HIF—1α與口腔白斑癌變的相關性研究

羅霞　周景喜　陳華志

[摘要] 目的 探討缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）在口腔白斑血管生成中的作用及其與口腔白斑術后復發的相關性與影響因素。 方法 免疫組化法檢測口腔鱗狀細胞癌、口腔白斑及口腔正常黏膜中HIF-1α的表達情況，熒光定量PCR法檢測microRNA表達。 結果 與口腔正常黏膜相比，口腔白斑microRNA相對表達量顯著增加，而口腔鱗癌與口腔白斑相比，microRNA相對表達量顯著增加，兩兩比較差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 HIF-1α在口腔白斑及白斑癌組織中過度表達，其可作為判斷口腔黏膜組織發生白斑病變及白斑癌變的標志物之一。

[關鍵詞] 缺氧誘導因子-1α；口腔白斑；血管生成

[中圖分類號] R739.8 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）05-0028-03

我國口腔頜面部鱗狀細胞癌多發于40～60歲的成年人，早期發現是目前預防與治療鱗癌的最佳方法，通過HIF-1α與口腔白斑癌變的相關性研究可以早期判斷白斑的性質?？谇火つぐ装呤强谇火つげ≈谐Ｒ姷囊环N疾病，國內外一直有大量學者在研究兩者的關系，探討HIF-1α在口腔黏膜白斑可能的相關發病機制，為口腔黏膜白斑的診斷、治療和預后判斷提供實驗依據[1]。本研究將采用免疫組化法測定口腔白斑組織中HIF-1α表達情況，并對其與口腔白斑發生及發展相關性進行分析，旨在為臨床口腔白斑的治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2005～2012年從本院病理科選取的口腔鱗狀細胞癌、口腔白斑及口腔正常黏膜石蠟切片標本各15例，三組病理組織學標本結果均由兩位資深的病理分析醫師共同確認。每個樣本均采用連續切片法，樣本的厚度為4 μm，具體資料見表1。

表1 實驗樣本基本資料

1.2 方法

1.2.1 microRNA含量的測定 采用RT-PCR（購于美國ADI公司）測定各組組織中microRNA含量，設計針對人microRNA的PCR探針序列以及熒光檢測引物，選擇人GAPDH（由美國BD公司提供）作為測試的內參物，并采用Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司）提取RNA，熒光定量PCR實驗嚴格按照試劑盒操作說明進行。microRNA相對表達量=目的基因/內參基因。

1.2.2 免疫組化法測定 采用免疫熒光組化法檢測兩組HIF-1α、VEGF表達情況，兔抗人VEGF多克隆抗體購于福州邁新生物技術公司，HIF-1α鼠抗人多克隆抗體購于北京金橋生物技術公司。HIF-1α采用EDTA熱修復處理20 min，VEGF采用檸檬酸緩沖液于高壓鍋中熱修復處理2 min后采用冷水洗滌，并采用PBS緩沖液對樣品進行沖洗，經蘇木精復染后采用乙醇對樣本脫水并制成中性樹膠封片，并與已知的陽性切片進行對比，陰性對照采用PBS緩沖液替代一抗的樣本為參照。

1.3 免疫組化結果判斷

①HIF-1α陽性表達為棕黃色顆粒見于細胞核內，VEGF陽性表達為棕黃色顆粒見于細胞質及細胞核內。②在倍數為100的顯微鏡下觀察細胞著色情況，根據著色程度由輕至重可分別計為0、1、2、3分。隨機選取5個視野點，采用倍數為400的顯微鏡進行觀察，每個視野進行細胞計數，以500個細胞作為一組計算單位，細胞陽性百分率：1分為<10%，2分為10%～50%，3分為>50%。積分計算：①與②計算所得的分值相乘。0分為陰性“-”，1～3分為弱陽性“+”，4～6分為中度陽性“++”，7～9分為強陽性“+++”[3]。

1.4 統計學分析

應用SPSS17.0軟件進行統計學分析，計數資料用相對數表示，組間比較采用χ2檢驗，HIF-1α與VEGF相關性采用Spearman相關分析，P < 0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 microRNA的相對表達量分析

與口腔正常黏膜相比，口腔白斑microRNA相對表達量顯著增加，而口腔鱗癌與口腔白斑相比，microRNA相對表達量顯著增加，兩兩比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見表2。

2.2 HIF-1α與VEGF陽性表達情況

正常黏膜、口腔白斑、口腔鱗癌中HIF-1α陽性表達率分別為0、73.30%、100.00%，而正常黏膜、口腔白斑、口腔鱗癌中VEGF陽性表達率分別為0、66.70%、100.00%。見表3。

表3 HIF-1α與VEGF陽性表達情況

注：與對正常黏膜相比，口腔白斑χ2=5.487，aP < 0.05；與口腔白斑相比，χ2=4.212，bP < 0.05

2.3 microRNA與HIF-1α、VEGF相關性分析

經相關性分析可知，microRNA與HIF-1α表達呈負相關（r=-0.452，P=0.000），與VEGF蛋白呈正相關（r=0.378，P=0.000）。

3 討論

口腔鱗狀細胞癌（OSCC）是口腔科中常見的惡性腫瘤，其臨床發生率約占全身惡性腫瘤發生率的3%～5%，約占口腔惡性腫瘤發生率的90%以上[2]。OSCC在我國是口腔頜面部中常見的惡性腫瘤，其臨床表現為早期淋巴結轉移、局部浸潤性強、預后差等特點，且該疾病容易轉化為萎縮型、長期糜爛型以及潰瘍型[3]。由于OSCC屬于上皮源性腫瘤，因此其發生經歷了與其他上皮細胞組織癌的發展過程相同，其發展過程經歷了正常細胞到癌前病變最后發展成為轉移性癌癥等系列動態過程，其參與過程復雜、屬于多階段發生的過程，其病變過程是受到多種基因調控來完成。

目前普遍認為，口腔白斑復發是由于內外因素共同作用引起的，血管生成是腫瘤發展的首要條件[4]。李德超等[5]認為，腫瘤周圍微環境中抑制因子及促進因子調控失衡是導致腫瘤血管生成的重要因素。VEGF是血管內皮細胞有絲分裂素，屬于重要的血管生成促進因子，其在血管生成過程中處于核心地位[6]。大量研究表明[7]，在正常成年人群中VEGF的表達水平非常低，而在惡性腫瘤患者中VEGF表達水平異常高。此外，VEGF可誘導血管、淋巴管內皮細胞遷移及增殖，促使淋巴血管及生成，并可增加淋巴血管通透性，加速淋巴血管轉移，因此與腫瘤惡性程度具有密切的關系。腫瘤患者體內普遍存在免疫識別障礙的情況，機體在此情況下可將腫瘤組織誤認為自身組織，從而產生應激反應，并誘導HIF-1α生成。HIF-1α表達增強可刺激腫瘤蛋白及基因轉錄，并促使VEGF大量生成。目前相關研究[8]表明，HIF-1α與腫瘤的發生發展具有密切的關系，在腫瘤發生發展過程中起到重要的調控作用。蔡勁等[9]研究指出，HIF-1α表達強度與癌癥患者總體生存期及術后復發率顯著相關，HIF-1α表達水平可作為，口腔白斑患者根治手術術后復發的預測指標。吳洋[10]對口腔白斑患者預后情況進行分析，其結果顯示口腔白斑患者己糖激酶-Ⅱ及HIF-1α表達強度與腫瘤大小、分化程度、臨床分期有密切關系，是影響患者術后預后的獨立危險因素。

本研究結果顯示，與口腔正常黏膜相比，口腔白斑microRNA相對表達量顯著增加，而口腔鱗癌與口腔白斑相比，microRNA相對表達量顯著增加，兩兩比較差異有統計學意義，經相關性分析可知，microRNA與HIF-1α表達呈負相關（r=-0.452，P=0.000），與VEGF蛋白呈正相關（r=0.378，P=0.000），從而提示HIF-1α陽性表達強度與患者生存率及生存期限具有密切的關系。正常黏膜、口腔白斑、口腔鱗癌中HIF-1α陽性表達率分別為0、73.30%、100.00%，而正常黏膜、口腔白斑、口腔鱗癌中VEGF陽性表達率分別為0、66.70%、100.00%，從而提示通過測定口腔白斑患者HIF-1α陽性表達情況，對預測患者病情進展具有重要的意義。HIF-1α在口腔白斑及白斑癌組織中過度表達，其可作為判斷口腔黏膜組織發生白斑病變及白斑癌變的標志物之一。

[參考文獻]

[1] 王霞，吳淑華，王培源，等. 口腔癌組織中HIF-1α的表達及其與腫瘤耐藥蛋白表達關系的研究[J]. 實用口腔醫學雜志，2011，27（5）：682-685.

[2] 王彥梅. HIF-1與口腔惡性腫瘤的研究進展[J]. 安徽醫科大學學報，2012，47（1）：100-103.

[3] 李善昌，劉芷君. HIF-1α、MMP-9及PTEN在舌鱗癌組織中的表達及意義[J]. 口腔醫學研究，2011，27（10）：896-898.

[4] 王淑紅，張雄，張勁娥，等. 兩個慢病毒真核表達載體pEGFP-N1-HIF-1α和pEGFP-N1-muHIF-1α的構建及檢測[J]. 中華口腔醫學雜志，2012，47（Z1）：244-247.

[5] 李德超，王健平，朱楊，等. 小干擾RNA干擾缺氧誘導因子-1α增強口腔鱗癌細胞株化療敏感性[J]. 生物技術通訊，2012，23（1）：49-51.

[6] 張勁濤，林凱金，賈永峰，等. 缺氧誘導因子-1α對口腔鱗狀細胞癌血管生成擬態相關基因影響的實驗研究[J]. 中華臨床醫師雜志（電子版），2012，6（19）：5814-5820.

[7] 高哲，南欣榮. HIF-1α和Glut-1在涎腺黏液表皮樣癌中的表達和臨床意義[J]. 實用口腔醫學雜志，2011，27（5）：686-689.

[8] 闕林，康非吾，高吟，等. 低氧誘導下舌鱗癌SCC-6細胞中HIF-1α、VEGF的表達及TSA對其表達的抑制[J]. 口腔頜面外科雜志，2012，22（4）：242-246.

[9] 蔡勁，任大宏，楊靜，等. 舌鱗癌組織中HIF-1α和VEGF表達及與腫瘤血管生成的關系[J]. 實用醫學雜志，2013， 29（8）：1215-1218.

[10] 吳洋. HIF-1α/VEGF信號通路對口腔癌生物學行為影響及診療意義[J]. 中國實用口腔科雜志，2012，5（12）：713-720.

（收稿日期：2013-11-01）