兒童支氣管哮喘急性發(fā)作時(shí)血清M2受體抗體的表達(dá)及臨床意義

張曉鳴 束靜蘭 厚平 呂進(jìn)泉

江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，江蘇鎮(zhèn)江212000

兒童支氣管哮喘急性發(fā)作時(shí)血清M2受體抗體的表達(dá)及臨床意義

張曉鳴 束靜蘭 厚平 呂進(jìn)泉

江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，江蘇鎮(zhèn)江212000

目的通過檢測兒童哮喘急性發(fā)作時(shí)M2受體抗體的變化來探討M2受體抗體對哮喘發(fā)作的影響。方法以合成的M2受體多肽片段為抗原，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測各組血清中M2受體抗體陽性率及抗體滴度，其中哮喘急性發(fā)作組20例，哮喘良好控制組20例，正常對照組30例。結(jié)果M2受體抗體陽性率和抗體滴度在哮喘急性發(fā)作期組（60.0%，1:90）與正常對照組（6.7%，1:20）、哮喘良好控制組（20.0%，1∶30）比較差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。結(jié)論M2受體抗體參與了兒童哮喘急性發(fā)作的過程并在其中起重要作用。

兒童；哮喘；M2受體抗體

支氣管哮喘是由多種炎癥細(xì)胞參與的氣道慢性炎癥。易感者對多種激發(fā)因子具有氣道高反應(yīng)性，并可引起氣道狹窄，反復(fù)出現(xiàn)發(fā)作性喘息、呼吸困難、胸悶、咳嗽等癥狀，嚴(yán)重影響患兒身心健康，是當(dāng)今世界最常見的慢性疾病之一。目前對哮喘的治療已經(jīng)規(guī)范，但對其病因、發(fā)病機(jī)制等仍有許多不明之處，各方均在進(jìn)行有意義的探討。近年來有許多學(xué)者對氣道副交感神經(jīng)毒蕈堿受體進(jìn)行了研究，其中毒蕈堿M2受體的研究最為深入，引起了廣泛關(guān)注［1-2］，本研究主要是通過檢測兒童哮喘急性發(fā)作和良好控制時(shí)M2受體自身抗體的變化，來探索哮喘急性發(fā)作機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

所有對象均來源于江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，將其分為三組：①哮喘急性發(fā)作組：2011年10月～2012年4月在兒科住院的哮喘患兒，隨機(jī)選擇20例，男11例，女9例；年齡13個(gè)月～14歲，其中＜3歲8例，≥3歲12例。所有病例的診斷均符合全國兒科哮喘防治協(xié)作組制訂的兒童哮喘防治常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)［3］。②哮喘良好控制組（來自同期兒科哮喘門診）：20例，男8例，女12例；年齡14個(gè)月～14歲，其中＜3歲7例，≥3歲13例，均按兒童哮喘防治常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)用藥，哮喘控制測試量表（ACT）［4］評分均在20分以上。③正常對照組（均為健康體檢兒童，來自同期兒科保健中心）：隨機(jī)選擇既往無哮喘病史，同期無呼吸道感染癥狀的30名兒童作為健康對照組，男13名，女17名；年齡13個(gè)月～14歲，其中＜3歲14名，≥3歲16名。三組患兒的年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。采集受檢查者清晨空腹靜脈血5 mL，離心取血清后-20℃儲存，備用。本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)通過，家屬均知情同意。

1.2 指標(biāo)檢測

抗原肽段用固相多肽合成法，由深圳晶美生物技術(shù)有限公司合成，相當(dāng)于人M2膽堿能受體細(xì)胞外第二環(huán)氨基酸序列的特異性抗原決定簇。M2肽段為169～193位的氨基酸序列：V-R-T-V-E-D-G-E-CY-I-Q-F-F-S-N-A-A-V-F-G-T-A-I-C。經(jīng)高壓液相色譜分析，合成肽的純度在95%以上。參照文獻(xiàn)［5-6］方法，用SA-ELISA檢測M2受體抗體，抗體定性判定用比例法，以陽性血清與陰性血清的吸光度（A）之比來判定（即P/N比值），P/N≥2.1為陽性（P/N=A值標(biāo)本-空白對照/A值陰性對照-空白對照）。判定抗體滴度：將血清標(biāo)本從1︰20起連續(xù)倍比稀釋，出現(xiàn)P/N≥2.1的最高稀釋度為該標(biāo)本抗體的滴度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，多組間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。幾何均數(shù)（G）表示抗體滴度的平均值，幾何均數(shù)的檢驗(yàn)用經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行。

2 結(jié)果

哮喘急性發(fā)作組M2受體抗體陽性率和抗體滴度均較正常對照組、哮喘良好控制組有明顯增高，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；哮喘良好控制組M2受體抗體陽性率和抗體滴度均較正常對照組無明顯增高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 三組M2受體自身抗體陽性率及滴度的比較

3 討論

支氣管哮喘是兒童常見的呼吸系統(tǒng)疾病，發(fā)病率高，且呈逐年增多趨勢。常首發(fā)于嬰幼兒，易反復(fù)發(fā)作，對患兒身心健康造成嚴(yán)重影響，并且家長誤工、患兒誤學(xué)，給家庭和社會(huì)都帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。隨著分子免疫學(xué)和分子遺傳學(xué)的發(fā)展，哮喘發(fā)病機(jī)制的研究也有了進(jìn)一步的深入和發(fā)展，但哮喘的發(fā)病機(jī)制仍有許多不明之處，各方均在進(jìn)行有意義的探討。

近年來有許多學(xué)者對氣道副交感神經(jīng)毒蕈堿受體進(jìn)行了研究，其中毒蕈堿M2受體的研究最為深入、廣泛。研究證實(shí)，經(jīng)毒蕈堿（M）受體共有5個(gè)亞型（M1～M5），而人肺支氣管平滑肌只表達(dá)其中的3種（M1、M2和M3）［7-8］。在氣道平滑肌上，主要表達(dá)M2及M3受體，M2受體主要位于節(jié)后膽堿能神經(jīng)纖維末梢，同時(shí)在小氣道平滑肌上也有M2受體的分布。M2受體又稱為自身受體，它的功能主要是通過負(fù)反饋的形式調(diào)節(jié)乙酰膽堿的釋放［9］。興奮性M3受體主要分布于氣道平滑肌以及黏膜腺體，僅M3受體參與支氣管平滑肌的收縮。迷走神經(jīng)節(jié)后纖維釋放乙酰膽堿，刺激氣道平滑肌上M3受體使肌肉收縮，同時(shí)乙酰膽堿與位于同一神經(jīng)末梢的M2受體相結(jié)合，從而產(chǎn)生負(fù)反饋，抑制了支氣管平滑肌的進(jìn)一步收縮。M2受體能控制乙酰膽堿的釋放，因此，M2受體在抑制迷走神經(jīng)引起的支氣管收縮中是起關(guān)鍵作用的。M2受體功能障礙時(shí)就會(huì)導(dǎo)致乙酰膽堿釋放過多，過多的乙酰膽堿作用于氣道平滑肌的M3受體，可引起氣道平滑肌進(jìn)一步收縮，同時(shí)黏液腺過度分泌，所以，本研究認(rèn)為M2受體功能障礙和氣道高反應(yīng)密切相關(guān)。近年來已有研究證實(shí)M2受體功能障礙可導(dǎo)致氣道高反應(yīng)，進(jìn)一步導(dǎo)致哮喘發(fā)作［10-11］。

關(guān)于M2受體功能障礙發(fā)生的機(jī)制還沒有完全闡明，目前有學(xué)者認(rèn)為內(nèi)源性阻斷劑可能和M2受體功能障礙有關(guān)，如嗜酸粒細(xì)胞主要堿性蛋白（MBP）的阻斷［12］。也有學(xué)者認(rèn)為神經(jīng)激肽A、P物質(zhì)等神經(jīng)肽能誘發(fā)和加重哮喘發(fā)作，與M2受體功能障礙有關(guān)［13］。但病毒感染能夠?qū)е翸2受體功能顯著喪失已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)［14］。

本研究中，兒童支氣管哮喘急性發(fā)作時(shí)的M2受體自身抗體陽性率和抗體滴度均顯著增高，提示M2受體自身抗體參與了兒童支氣管哮喘急性發(fā)作過程。呼吸道病毒感染為促發(fā)哮喘發(fā)作的主要因素之一［15-16］，80%～85%的學(xué)齡兒童在哮喘發(fā)作時(shí)病毒陽性，且大多數(shù)為鼻病毒（RV）［17］。研究表明，病毒感染能引起M2受體功能障礙［18-19］，但具體機(jī)制尚未完全闡明。病毒感染造成氣道上皮壞死，纖毛上皮細(xì)胞脫落，本研究推測病毒感染后導(dǎo)致小氣道平滑肌上抗原暴露，隱蔽抗原產(chǎn)生，在部分特異性體質(zhì)患兒中誘導(dǎo)機(jī)體自身免疫應(yīng)答，從而產(chǎn)生抗M2受體自身抗體。抗自身受體的抗體一旦與受體結(jié)合，就能夠封閉受體，從而對M2受體功能的正常發(fā)揮產(chǎn)生影響，進(jìn)而導(dǎo)致或者加重支氣管哮喘的急性發(fā)作。哮喘良好控制組M2受體抗體陽性率和滴度正常，可能是控制哮喘時(shí)使用了激素有關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)大鼠哮喘模型M2受體抗體陽性率和滴度明顯增高，用地塞米松后恢復(fù)正常，提示激素抑制自身免疫，明顯減少了M2受體抗體的形成［20］。

盡管本研究的病例數(shù)不夠多，資料獲得也有限，但結(jié)果仍可提示自身免疫可能是哮喘急性發(fā)作的重要機(jī)制。支氣管哮喘急性發(fā)作時(shí)M2受體自身抗體陽性率顯著增高，抗自身受體的抗體與受體結(jié)合，封閉受體，從而對M2受體功能的正常發(fā)揮產(chǎn)生影響。所以筆者推測M2受體抗體的產(chǎn)生是M2功能障礙發(fā)生的主要原因之一，也是兒童支氣管哮喘急性發(fā)作的重要機(jī)制。

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Expression and significance of autoantibodies against M2-muscarinic receptor in acute attack of bronchial asthma in children

ZHANG XiaomingSHU JingLAN HoupingLU Jinquan
Department of Pediatrics,the Affiliated Hospital of Jiangsu University,Jiangsu Province,Zhenjiang212000,China

Objective To investigate the effects of autoantibodies against M2-muscarinic receptor in acute attack of bronchial asthma in children.Methods The positive rate of autoantibodies against M2-muscarinic receptor and the antibody titer in the serum were detected by ELISA using synthesized peptide fragment of M2-muscarinic receptor in 3 groups:asthma acute attack(n=20),asthma well control(n=20),and normal control(n=30).Results The positive rate of autoantibodies against M2-muscarinic receptor and the antibody titer in the serum from acute asthma group (60%,1:90)were much higher than those from normal control group(6.7%,1:20,P＜0.01)and asthma well control group(20%,1:30,P＜0.01).Conclusion There is a close relationship between the autoantibodies against M2-muscarinic receptor and the pathogenetic condition of asthma in children,it may play a very important role in the development of asthma.

Children;Asthma;Autoantibodies against M2-muscarinic receptor

R562.25

A

1673-7210（2014）09（b）-0078-03

2014-04-14本文編輯：張瑜杰）

江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)臨床科技發(fā)展基金項(xiàng)目（編號JLY2010139）。