新靶點(diǎn)CyclinE干擾RNA對(duì)人腦膠質(zhì)瘤侵襲能力的影響

呼格吉樂　高乃康　韓艷秋

[摘要] 目的 構(gòu)建人CyclinE新靶點(diǎn)的干擾RNA真核表達(dá)載體，觀察CyclinE表達(dá)受抑制后的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力的變化。 方法 構(gòu)建4個(gè)新靶點(diǎn)CyclinE干擾RNA的真核表達(dá)載體后，用雙酶切和堿基序列測(cè)定，轉(zhuǎn)染載體到膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株，將其分為U251組、PNC-U251組、PCyclinE-1-U251組、PCyclinE-2-U251組、PCyclinE-3-U251組、PCyclinE-4-U251組。通過RT-PCR的結(jié)果檢測(cè)各組CyclinE mRNA的表達(dá)量，將干擾效果最好的一組用Transwell小室法檢測(cè)侵襲能力的變化。 結(jié)果 成功構(gòu)建了新靶點(diǎn)CyclinE干擾RNA真核表達(dá)載體即PCyclinE-1、PCyclinE-2、PCyclinE-3、PCyclinE-4，而且CyclinE mRNA表達(dá)受到抑制，其中PCyclinE-1-U251組的穿膜細(xì)胞數(shù)為（45.4±2.7）個(gè)，U251組和PNC-U251組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（75.2±2.9）個(gè)和（74.4±3.5）個(gè)，U251組和PNC-U251組的穿膜細(xì)胞數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 1.23，P = 0.31），PCyclinE-1-U251組和U251組的穿膜細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 15.00，P = 0.00），PCyclinE-1-U251組和PNC-U251組的穿膜細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 13.81，P = 0.00）。 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了新靶點(diǎn)CyclinE干擾RNA真核表達(dá)載體，PCyclinE-1-U251細(xì)胞侵襲能力減弱。

[關(guān)鍵詞] 干擾RNA；細(xì)胞周期蛋白E；侵襲

[中圖分類號(hào)] R733.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）09（b）-0009-04

人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最為常見的腫瘤之一，但是由于其侵襲性能力強(qiáng)，增殖速率快，導(dǎo)致預(yù)后極差[1]。尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，惡性程度最高，但是其發(fā)病機(jī)制目前仍不明確，而且沒有像甲胎蛋白、人附睪蛋白、前列腺特異性抗原等常用且有效的腫瘤標(biāo)志物[2-3]。正常的人腦膠質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞的最大區(qū)別就在于許多和細(xì)胞周期調(diào)控的基因發(fā)生了改變，細(xì)胞周期蛋白E（CyclinE）就是其中之一。CyclinE在人腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)，與細(xì)胞周期蛋白質(zhì)依賴激酶2（cyclin-dependent kinase，CDK2）結(jié)合促進(jìn)pRB的磷酸化，并且和細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制因子家族的基因結(jié)合在一起形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1到S進(jìn)程繼續(xù)下去。CyclinE過量表達(dá)會(huì)使G1期縮短，導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入S期的時(shí)間提前，干擾細(xì)胞核核酸復(fù)制和分裂，導(dǎo)致腫瘤的形成[4-5]。因此，研究CyclinE表達(dá)的下調(diào)顯得非常有意義，每個(gè)基因都不是單獨(dú)存在并且發(fā)揮作用的，CyclinE也不例外其表達(dá)的下調(diào)會(huì)影響哪些基因的表達(dá)和功能還有待醫(yī)學(xué)工作者去研究。干擾RNA技術(shù)能夠特異的使基因沉默，近年已經(jīng)作為一個(gè)常規(guī)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用于腫瘤基因?qū)W研究的多個(gè)領(lǐng)域。本研究利用RNA干擾技術(shù)設(shè)計(jì)并構(gòu)建了新的CyclinE干擾RNA真核表達(dá)載體，采用雙酶切和堿基序列測(cè)定的方法鑒定Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染成功構(gòu)建的4個(gè)載體到膠質(zhì)瘤細(xì)胞，通過檢測(cè)轉(zhuǎn)染后CyclinE mRNA表達(dá)量，篩選出沉默效果最好的一個(gè)載體，為后續(xù)在CyclinE沉默后用雙向電泳技術(shù)研究蛋白質(zhì)組學(xué)的變化以及用基因芯片技術(shù)研究轉(zhuǎn)錄水平變化奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫，DNA內(nèi)切酶、DNA連接酶購自MBI公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自上海英駿公司，DNA凝膠回收試劑盒、瓊脂糖等購自北京天根生化科技有限公司，Transwell小室購自Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

本實(shí)驗(yàn)將沒有轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的組定為U251組；將轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒的組設(shè)為PNC-U251組；將轉(zhuǎn)染PCyclinE-1質(zhì)粒的組設(shè)為PCyclinE-1-U251組；將轉(zhuǎn)染PCyclinE-2質(zhì)粒的組設(shè)為PCyclinE-2-U251組；將轉(zhuǎn)染PCyclinE-3質(zhì)粒的組定為PCyclinE-3-U251組；將轉(zhuǎn)染PCyclinE-4質(zhì)粒的組定為PCyclinE-4-U251組。

1.2.2 新靶點(diǎn)CyclinE干擾RNA的構(gòu)建

1.2.2.1干擾載體的靶序列 4對(duì)siRNA的靶序列即干擾部位為：PCyclinE-1：5'-GGATGGTTCCATTTGCCATGG-3'；PCyclinE-2：5'-GCTTCGGCCTTGTATCAT TTC-3'；PCyclinE-3：5'-GCCAGCCTTGGGACAATAA TG-3'；PCyclinE-4：5'-GCCCTTAAGTGGCGTTTAAG T-3'。同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照（NC）。

1.2.2.2 干擾載體的檢驗(yàn) 把所提取的質(zhì)粒用BamHⅠ，PstⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定。正確的重組載體不會(huì)被PstⅠ切開但是會(huì)被BamHⅠ切開。酶切結(jié)果正確的質(zhì)粒用堿基序列測(cè)定方法鑒定載體構(gòu)建成功與否。

1.2.3 干擾質(zhì)粒對(duì)U251細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，把經(jīng)過鑒定正確的質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合后分別加入人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中混合培養(yǎng)，48 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染組CyclinE mRNA表達(dá)

提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，CyclinE上游引物為5'-ACCAGTTTGCGTATGTGAC-3'，下游引物為5'-CTGCTCTGCTTCTTACCG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為583 bp。磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）上游引物為5'-CGGGAAACTGTGGCGTGAT-3'，下游引物為5'-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為300 bp。每組設(shè)3個(gè)平行樣本，即每組的PCR產(chǎn)物分別平行的加到3塊1.5%瓊脂糖膠上分離，用凝膠分析軟件分析條帶光密度。CyclinE平均光密度值（IDV）與GAPDH的IDV比值（IDVCyclinE/IDVGAPDH）即為CyclinE mRNA的相對(duì)表達(dá)量，本實(shí)驗(yàn)以U251組的CyclinE mRNA的相對(duì)表達(dá)量為“1”，計(jì)算各組的干擾效率=[1-（每組的CyclinE mRNA的相對(duì)表達(dá)量）/（U251組CyclinE mRNA的相對(duì)表達(dá)量）]×100%。

1.2.5 Transwell小室法侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力

把Transwell小室按照操作說明書制備好后，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整至5×105個(gè)/mL。在Transwell小室的上室中加入含2×105個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)基400 μL，培養(yǎng)箱中放置12 h。吸去上室的液體，再用濕棉簽擦去半透膜表面的細(xì)胞，常規(guī)HE染色或吉姆薩-瑞氏雙染。每組設(shè)3個(gè)平行樣本，每張膜計(jì)數(shù)5個(gè)視野，取細(xì)胞數(shù)的平均值，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.1統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 酶切和測(cè)序結(jié)果

雙酶切檢測(cè)和堿基序列測(cè)定結(jié)果表明，所有的CyclinE真核表達(dá)載體以及陰性對(duì)照載體均與所設(shè)計(jì)的序列完全相同，并且沒有發(fā)現(xiàn)任何異常。見圖1。

2.2 CyclinE干擾RNA真核表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染結(jié)果

于轉(zhuǎn)染24 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞，除U251組外其他各組均有綠色熒光蛋白表達(dá)。

2.3 轉(zhuǎn)染干擾RNA真核表達(dá)載體后CyclinE mRNA水平

結(jié)果顯示，PCyclinE-1-U251組的干擾效率最高，達(dá)到77%，因而后續(xù)的侵襲實(shí)驗(yàn)采用該組作為實(shí)驗(yàn)組。見表1、圖2。

2.4 轉(zhuǎn)染CyclinE干擾RNA對(duì)U251細(xì)胞侵移能力的影響

計(jì)數(shù)每個(gè)200倍視野下的12 h穿膜細(xì)胞數(shù)，PCyclinE-1-U251組的穿膜細(xì)胞數(shù)為（45.4±2.7）個(gè)，U251組和PNC-U251組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（75.2±2.9）、（74.4±3.5）個(gè)，U251組和PNC-U251組的穿膜細(xì)胞數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.23，P=0.31），PCyclinE-1-U251組和U251組的穿膜細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.00，P=0.00），PCyclinE-1-U251組和PNC-U251組的穿膜細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.81，P=0.00）。

3 討論

RNA干擾的原理是21～25 bp的小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）通過和Dicer酶等復(fù)合物的一系列作用使得同源序列mRNA發(fā)生降解[6]。干擾RNA技術(shù)能夠特異的使基因沉默，近年已經(jīng)作為一個(gè)常用的手段應(yīng)用于研究腫瘤的基因的多個(gè)領(lǐng)域：新抗腫瘤藥中的研究[7]；腫瘤細(xì)胞中基因的改變引起侵襲能力、生長(zhǎng)速率、細(xì)胞凋亡水平變化、組蛋白甲基化等的研究[8-10]；腫瘤早期發(fā)生發(fā)展時(shí)異常變化[11]相關(guān)研究。介導(dǎo)siRNA的載體主要有化學(xué)合成的小片段、質(zhì)粒和慢病毒3種，化學(xué)合成的小片段廉價(jià)但是轉(zhuǎn)染效率低而且只適合瞬時(shí)轉(zhuǎn)染；慢病毒介導(dǎo)載體適合穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，能夠使得目的基因整合到基因組中[12]，但是有一定的危險(xiǎn)性，不適合一般的實(shí)驗(yàn)室使用，所以本研究選用了質(zhì)粒作為介導(dǎo)的載體，既可以做瞬時(shí)轉(zhuǎn)染也適合穩(wěn)定轉(zhuǎn)染且安全性高。

有研究表明，CyclinE過量表達(dá)會(huì)使會(huì)使得G1期縮短，導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入S期的時(shí)間提前，干擾細(xì)胞核核酸的復(fù)制和分裂，和骨肉瘤、卵巢癌、鼻咽癌、宮頸癌等腫瘤的侵襲有密切的關(guān)系，是導(dǎo)致腫瘤的形成原因之一[13-16]。但是在關(guān)于CyclinE在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)和作用少有報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)就CyclinE在膠質(zhì)瘤的侵襲中的作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)CyclinE被干擾后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力減弱。

膠質(zhì)瘤的產(chǎn)生、發(fā)展不是某一個(gè)基因的作用，如P27蛋白在細(xì)胞中可以降解CyclinE-CDK2復(fù)合物從而抑制細(xì)胞的增殖和分裂[17]。E2F蛋白、錨 蛋 白Ankrd17可以促進(jìn)CyclinE基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[18]。因此CyclinE不是單獨(dú)存在并且發(fā)揮作用的，它表達(dá)的下調(diào)會(huì)影響許多基因的表達(dá)和細(xì)胞的一系列功能。這些基因有可能在膠質(zhì)瘤的形成和發(fā)展中起非常重要的作用。所以本實(shí)驗(yàn)利用RNA干擾技術(shù)使得CyclinE沉默，且沉默效果顯著，并使得增殖能力和侵襲能力減弱。除去CyclinE在細(xì)胞周期中的直接作用外，因?yàn)镃yclinE和CDK2結(jié)合后才能發(fā)揮作用，所以當(dāng)CyclinE沉默后它們的結(jié)合復(fù)合體減少，可能也引起CDK2的表達(dá)減弱，當(dāng)CDK2表達(dá)減弱時(shí)也會(huì)引起細(xì)胞生長(zhǎng)速率降低、侵襲能力降低[19]。當(dāng)然也可能和波形蛋白等許多和腫瘤侵襲、代謝相關(guān)的蛋白共同作用的結(jié)果。這就需要用雙向電泳技術(shù)研究蛋白質(zhì)組學(xué)的變化以及用基因芯片技術(shù)研究轉(zhuǎn)錄水平變化，而本實(shí)驗(yàn)為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

綜上所述，當(dāng)本研究干擾RNA的技術(shù)使得CyclinE沉默后，再用雙向電泳及基因芯片技術(shù)來做相應(yīng)的研究就可能發(fā)現(xiàn)一系列有意義的、相關(guān)的差異表達(dá)的基因和蛋白質(zhì)，為膠質(zhì)瘤的研究提供有價(jià)值的資料。

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（收稿日期：2014-04-04 本文編輯：任 念）

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（收稿日期：2014-04-04 本文編輯：任 念）

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（收稿日期：2014-04-04 本文編輯：任 念）