載脂蛋白E 基因啟動子區多態性分布在新疆哈漢民族冠心病患者之間差異性研究①

陶社學 李金興 雷玉艷 林 爽 (新疆醫科大學研究生院，烏魯木齊 830011)

近年來，國內外關于載脂蛋白E(APOE)啟動子區多態性與冠心病(Coronary heart disease，CHD)相關性研究日益增多，但在不同人種及種群研究中，結果不盡相同，考慮可能與不同人群中APOE 基因上游轉錄調控區域點突變或多態性不同有關〔1，2〕。本研究從新疆漢族及新疆第二大少數民族哈薩克族出發，探討兩民族冠心病患者載脂蛋白E 基因啟動子區多態性在兩民族之間的分布是否存在差異。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取長期生活在新疆地區的具有一定民族代表性的哈、漢民族冠心病病人，根據冠脈造影結果及WHO 1979 年CHD 診斷標準確定冠心病組。其中符合冠心病診斷標準哈薩克族104 例，平均年齡64 歲，男性占59.26%，有冠心病、高血壓病家族史者占14.8%。漢族冠心病人97 例，平均年齡65 歲，男性占62%，有冠心病家族史者占9.6%;有高血壓家族史的占17.0%;其中冠心病合并高血壓的患者占57.5%，冠心病合并糖尿病患者占25.6%。本研究開始前，已告知患者并得到患者及其家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取ApoE 啟動子區基因型的測定 采集哈、漢兩民族冠心病病人空腹血液標本，ACD抗凝，蛋白酶K 消化后，酚-氯仿抽提提取DNA［3］;利用SNaPshot SNP 分型技術對所得201 個樣本進行3 個SNP 位點分型。具體實驗步驟:(1)電泳DNA 樣本對其進行質量檢查以及濃度的估計;(2)PCR 反應，PCR 引物:rs405509F:GCACAGGAAAGGACAGGGTCAG;rs405509R:CAGTCACGAGGTGGGCTGTTCT;rs449647F:TCCCTCTTGCTGAGGCTGGAGT;rs4-49647R:GCCACGTGGGCGAATCACTTA;rs7259620F:GGAGCCAGGAATGAGT-CCCAGT;rs-7259620R:GCACGGGTATGTTTGGTGA-CAA;反應體系(20 μl)包含1 ×GC Buffer Ⅰ，3.0 mmol/L Mg2+，0.3 mmol/L dNTP，1 U HotStarTaq polymerase (Qiagen Inc.)，1 μl 樣本DNA 和2 μl 多重PCR 引物。再對PCR 產物進行純化。(3)SNaPshot 多重單堿基延伸反應延伸引物:rs405509SR:TTTTTTTTTTTTTTTAGGACACCTCGCCCAGTAAT;rs449647SR:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGAATCAC-TTAAGGTCAGGAG;rs7259620S-R:TTTTTTTTCCGTGGTTCAGCAGCAAGA。延伸反應體系(10 μl)包括5 μl SNaPshot Multiplex Kit(ABI)，2 μl 純化后多重PCR產物，1 μl 延伸引物混合物，2 μl 超純水。(4)純化后得到的延伸產物在ABI3130XL 基因分析儀上進行測序。

1.3 統計學方法 根據測序結果確定每個標本的等位基因型或基因型頻率，應用SPSS17.0 軟件計算各等位基因和基因型頻率的分布，組間基因型頻率和等位基因頻率差異比較用χ2檢驗，以P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 APOE 啟動子區多態性分布 本研究中，APOE 啟動子區各位點基因型及等位基因頻率均符合遺傳學Hardy-Weinberg 定律(P ＞0.05)，顯示研究樣本為遺傳平衡群體。

2.1.1 APOE 啟動子區基因多態性的分布在哈、漢冠心病病人中差異性研究 APOE 啟動子區三個位點各基因型及等位基因在哈、漢冠心病病人中的分布情況見表1～3。結果提示新疆地區哈薩克族與漢族患者中載脂蛋白E 基因啟動子區rs449647(AT)位點基因型及等位基因在兩民族之間差別具有統計學意義(P ＜0.05)，見表2。rs405509(G-T)位點及rs7259620(G-A)位點基因型及等位基因在兩民族之間差異均無統計學意義(P ＞0.05)，見表1、3。

表1 rs405509(G-T)位點基因型和等位基因頻率分布Tab.1 Rs405509(G-T)genotype and allele's frequency distribution

表2 rs449647(A-T)位點基因型和等位基因頻率分布Tab.2 rs449647(A-T)genotype and allele's frequency distribution

表3 rs7259620(G-A)位點基因型和等位基因頻率分布Tab.3 rs7259620(G-A)genotype and allele's frequency distribution

3 討論

近年有證據表明，載脂蛋白E 啟動子區-219(G/T)、-427 C/T 和-491 A/T 位點多態性與心血管疾病的發生有關〔1，4-6〕。在這些區域可以在體內通過各種等位形式調控APOE 基因的表達及組織特異性，從而可能影響心血管等疾病的發病及轉歸。因此，APOE 基因也可能通過其轉錄調控區域的堿基置換改變ApoE 蛋白的表達量，從而增加對心血管疾病嚴重程度的影響［5，6］。

本研究從漢族及新疆第二大少數民族哈薩克族出發，結果發現在兩民族冠心病病人之間APOE 啟動子區rs449647(A-T)位點基因型及等位基因之間差別有統計學意義，提示該位點可能在兩民族之間存在差異，這與李光榮等［7］關于載脂蛋白E 啟動子區SNP 的分布及頻率與種族和地域因素有關的研究結論相一致，哈薩克族以游牧民族為主，注重高鹽、高脂，導致飲食中高熱量飲食的攝入增加，使APOE 基因上游轉錄調控區域發生點突變或多態可能性增加，從而改變ApoE 蛋白的表達量，在一定程度上影響脂代謝，加速了動脈粥樣硬化病變的過程，導致CHD 的發生。其他兩個位點在兩民族之間差別均無統計學意義，究其原因而言一方面可能是久居新疆的漢族在飲食、環境等方面與當地少數民族相似，造成二者之間無差異的可能，也可能與本研究所選樣本代表性欠佳及樣本量不夠大有關，還應進一步擴大樣本含量及提高樣本代表性，使本研究準確性達到更高的水平，進而可以從分子生物學水平進一步了解同一地區不同民族之間冠心病發病的危險因素以及積極因素，起到預防疾病的作用。

本研究僅僅從rs405509(G-T)、rs449647(AT)、rs7259620(G-A)位點出發，選擇范圍較為局限，不能排除ApoE 基因轉錄調控區可能有其他的SNP影響ApoE 基因的表達，在以后的研究中可繼續擴大研究區域，尋找其他可影響ApoE 基因表達的SNP。

［1］Banares VG，Ariel Bardach，Graciela Peterson，et al.APOE -249T allele may reduce the risk of atherosclerotic lesions among middleaged women［J］.Mol Cell Biochem，2012，362:123-131.

［2］Ozturk Z，Enkhmaa B，Shachter NS，et al.Integrated role of two apoliprotein E polymorphisms on apolipoprotein B levels and coronary artery disease in a biethnic population［J］.Metab Syndr Relat Disord，2010，8(6):531-538.

［3］嚴冰冰，虞 濤，方華紅，等.應用實時熒光PCR 分析apoE3、4等位基因［J］臨床檢驗雜志，2008，26(3):197-199.

［4］Lambert JC，Brousseau T，Myllykangas L，et al.Independent association of an APOE gene promoter polymorphismwith increased risk of myocardial infarction and decreased APOE plasma concentrations-the ECTIM study［J］.Hum Mol Genet，2000，9:57-61.

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［7］李光榮，趙明祥.載脂蛋白E 基因啟動子-307～-7 區單核苷酸論著多態性與散發阿爾茨海默病的相關研究［J］.臨床和實驗醫學雜志，2010，9(10):721-722.