脂質筏神經鞘磷脂在T 細胞活化中的作用①

黃成日 (延邊大學附屬醫院婦產科，延吉 133000)

機體通過正確地調節活化免疫細胞的信號傳遞，抵抗入侵的病原微生物。其中獲得性免疫起主要作用，主體為T 淋巴細胞或B 淋巴細胞。細胞膜上的T 細胞受體集中在免疫突觸的中央，與抗原提呈細胞結合形成免疫突觸［1］。1972 年Nicolson 提出細胞膜液態鑲嵌模型，當時這一重大發現在學界引起了轟動。隨著對細胞膜研究的深入，近年，脂質組學逐漸受到了關注。1997 年Simons 和Ikonen 提出了［由神經鞘脂質和膽固醇形成的區域叫脂質筏，它在細胞黏附和運輸膜蛋白的過程中發揮重要作用］的筏模型［2］。2001 年，在西班牙召開的歐洲生物科學研討會上正式提出了“脂質筏(Lipid Raft)”的概念。脂質筏是細胞膜上的功能微區，可以在膜中側向流動、聚集，從而完成信號轉導、物質轉運等功能。脂質筏對維持T 細胞穩態發揮重要作用，認清T 細胞活化與脂質筏的密切關系有著重要意義。研究表明，改變脂質筏的完整性會影響T細胞的功能，引起各種疾病。神經鞘磷脂(Sphingomyelin，SM)是脂質筏的主要構成成分，在細胞膜上跨膜信號轉導中發揮重要作用。本文主要對脂質筏SM 在T 細胞活化中的作用進行綜述。

1 脂質筏的結構

脂質筏存在于細胞生物膜上的特殊微區(microdomain)，不被去垢劑溶解，又稱detergent resistant fractions(DRF)［3］。這些由磷脂質、鞘磷脂和膽固醇組成的脂質將細胞膜分為功能不同的區域，保持一種液態有序相，不溶于去垢劑。這個區有許多名稱:不溶于去垢劑的糖脂富含區(Detergent-insoluble glycolipid-rich domain，DIGs)，不溶于去垢劑的膜(Detergent resistant membrane，DRMs)，富含糖脂的膜(Glycolipid-rich membrane，GEMs)，Triton 不溶復合物(Triton insoluble complexes，TIC)［4］。脂質筏富含膽固醇和鞘脂，包括鞘磷脂和鞘糖脂(glycolsphingolipids)，如神經節苷脂GM1、GM2、GM3 等。并有特定的蛋白質，如GPI(糖基磷脂酰肌醇)錨定蛋白等信號轉導蛋白，TCR、BCR、生長因子等跨膜轉運蛋白和功能蛋白;以及一些標記蛋白caveolin、flotillin、stomatin 等。目前脂質筏分為小窩、富含糖鞘脂膜區、富含多磷酸肌醇膜區三種類型，不同類型含有某些特有的蛋白質，故將這些蛋白稱為標記蛋白，如caveolin 是caveolae 上的標記蛋白，flotillin、stomatin是富含PIP2 膜區的標記蛋白［5］。鞘糖脂中GM1 是神經節苷脂的一種，相對分子量為11 500，因其能與霍亂毒素-B 亞基特異性的結合，常作為脂質筏的標記分子。到目前為止對筏的鑒定是以筏中的GM1的霍亂毒素B 亞基(cholera toxin B subunit;CTx)為探針進行分析的。筏的功能解析是用甲基-β-環湖精(methyl-β-cyclodextrin;MβCD)來進行的［6］。但是，對脂質筏的主要構成成分的SM 的解析報道甚少。

通常，因為磷脂質具有氫受體(Hydrogen acceptor)，不具有供氫體(Hydrogen donor)，因而磷脂質之間不易結合，含多加不飽和脂肪酸的部分不對稱，不易形成聯網狀態。但是，飽和脂肪酸的SM 具有與氫結合必需的氫受體和供氫體，因而脂質雙層結構中容易形成聯網狀態。其脂質分配是不均一的，維持著非對稱性。即具有頭部膽堿的SM 或磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine，PC)等的飽和磷脂質存在于細胞膜雙重結構的外層(Exoplasmic leaflet);磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)、磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine，PE)或 磷 脂 酰 肌 醇(Phosphatidylinositol，PI)等的不飽和磷脂質存在于內層(Cytoplasmic leaflet)。膽固醇則填充脂質雙層間隙之中［7］，通過酰基(acyl)鏈結合于SM，填補SM 間隙。這就是筏的實體，SM 和膽固醇密集的區域［6，8］。到目前為止已知的Ras 還有很多的酪氨酸激酶、接頭蛋白等各種信號傳導物質聚集在筏(表1)。TCR的信號傳導為由通過聚集在筏的Lck 或Fyn 等酪氨酸激酶或LAT(linker for activation of T cells)信號傳導來實現的。

前面已提到生物膜上存在由脂質構成的不同的微結構域和神經鞘脂質密集的細胞膜外層區域在細胞黏著或活化時起運輸膜蛋白的作用。可見膜脂質不是生物膜靜止的構成成分，而是動態移動，將情報提供給各種各樣的功能分子的匯合或集聚部位，而轉導重要的信號。

2 脂質筏的功能

脂質筏是蛋白質和脂質停留和活動的平臺。脂質筏在整個信號轉導過程中起到一個平臺的作用。細胞受刺激時，筏中的SM 迅速相互聯結凝集成更大的微結構區，這些結構又可以迅速形成一個或多個平臺。這個過程可以理解成脂質筏由小的、無活性的狀態轉化為大的、有活性的狀態，即平臺的形成。脂質筏選擇性地聚集不同的蛋白質于細胞膜的兩側，脂質筏中的脂質對其進行修飾使蛋白嵌入脂質筏中。脂質筏在膜中側向流動可使多種距離較遠的蛋白質聚集在脂質筏內，便于信號轉導［9］。脂質筏還參與信使的形成、跨膜轉運、突觸傳遞、細胞膜非對稱性的維持、抗腫瘤、抗感染、細胞的增殖與凋亡及胰島素調節等［10，11］。

表1 筏中局限或集聚的分子Tab.1 Localized molecules cluster in raft

3 T 細胞活化與脂質筏

T 細胞活化需要兩個信號:第一信號的產生依賴于TCR 與抗原提呈細胞(APC)所提呈的抗原肽-主要組織相容性復合體(MHC)復合物特異性結合，第二信號則來自于共刺激信號。APC 將共刺激分子(B7-1、B7-2、VCAM、ICAM、LFA 等)抗原提呈給特異性T 細胞，兩種細胞表面黏附因子圍繞TCR/抗原肽-MHC 凝聚，形成一狹小空間，即免疫突觸。突觸中存在一個由TCR 為中心族聚集而成的中央超分子活化簇［12］。

1998 年，美國癌研究所Samelson 等［13］研究人員發現linker for activation of cell(LAT)，闡明LAT 是局限在筏的結合蛋白，首次論證TCR 信號與筏的關系。TCR 與抗原肽-MHC 復合物特異性結合時，引起TCR 交聯。TCR 交聯時，TCR 復合物中的CD3、CD4 等膜分子發生聚集，CD3ξ 鏈的 immunoreceptor tyrosine-based activation motif(ITAM)受到磷酸化，磷酸化ITAM 里結合Syk 酪氨酸激酶屬的ZAP-70 后，與Lck 協同作用下酪氨酸磷酸化LAT、SLP-76 等結合蛋白。進而，通過磷酸化LAT、SLP-76、PLC-γ、Grb2、PI-3kinase、Cbl、Vav、SKP-76等的信號因子聚集在筏里［13］(圖1)。LAT 以后的信號途徑是Grb2 或SOS→Ras，Gads，SLP-76;Vav→Rac/cdc42;Nck，Wasp→肌動蛋白聚合;PLC-γ，Gads，SLP-76 →流入到細胞內。伴隨著T 細胞活化，以LAT 為首的重要的激酶或結合蛋白和TCR 自身集聚在筏。但是，LAT 一直局限于筏中而TCR 是未受到刺激時不存在于筏中。那么，什么時間段和以什么方式TCR 移動到筏，尚不清楚。最近還有一種報道稱，TCR 在筏中凝聚之前或微小群集形成時TCR活化信號傳遞到LAT，其機制尚不清楚。［12，14］

4 靶向神經鞘磷脂的脂質筏解析的新策略

越來越多的研究顯示，神經酰胺作為細胞內信號傳導的第二信使，在腫瘤細胞增殖、信號傳遞、蛋白質相互作用、黏附和凋亡中發揮很重要的作用。SM/神經酰胺循環如下:SMase(Sphingomyelinase)促進SM 水解神經酰胺磷脂酰膽堿為神經酰胺和磷脂酰膽堿。神經酰胺酶(Ceramidase)分解神經酰胺形成神經鞘氨醇(Sphingosine)。神經酰胺在SMS作用下可轉變為SM。神經酰胺重新合成開始于內質網的絲氨酸軟脂酰轉移酶催化的絲氨酸和軟脂酰-CoA 凝集，隨后的一系列反應產生ER 細胞質內神經酰胺。如此，存在于細胞膜脂質雙重結構外葉的SM 和細胞質內的神經酰胺之間形成SM/神經酰胺周期，日常維持平衡(見圖1)。這種SM-神經酰胺途徑介導的信號傳導已被證實是廣泛存在的。

圖1 神經鞘磷脂/神經酰胺代謝示意圖Fig.1 Schematic diagram of sphingomyelin and ceramide metabolism

很多一流雜志上刊登了有關脂質筏的論文。但是，到目前為止對筏的檢測是以筏中的GM1 的霍亂毒素B 亞單位為探針進行分析的。筏的功能解析是用MβCD 破壞筏的方法進行的。但是，對脂質筏的主要構成成分的SM 的解析幾乎沒有報道。因為沒有發現神經鞘磷脂合成酶(Sphingomyelin synthesis;SMS)基因，所以SM 合成經路或SM 可視化方法沒確立下來。我們研究小組克隆神經鞘磷脂合成酶基因SMS1、SMS2 和SMS3，并發現SM 特異性結合的標志物lysenin。用lysenin 的敏感性來確定細胞膜的SM。

我們將SMS1 基因轉入到無SM 的細胞株［WR/Fas-SM(-)］使其成為存在SM 的細胞株［WR/Fas-SMS1］。兩者Fas 表達量及細胞膜膽固醇與神經節苷脂GM1 的量同等，但用lysenin 鑒定時只有WR/Fas-SMS1 表達SM。利用兩者首次闡明在筏的集聚或凋亡中的SM 的重要性［15］。

5 SM 沉默的細胞株和敲除小鼠模型的制備及解析

SM 是脂質筏的重要構成成分，分布于細胞膜脂質雙層結構的外層，發揮維持脂質雙層結構的對稱性的作用，作為脂質筏的標志物與神經節苷脂GM1 發揮同樣的重要作用。所以，我們將神經鞘磷脂酶基因SMS1-siRNA 轉染于jurkat T 細胞，建立SM 沉默的細胞株，分析其TCR 信號及細胞活化可見沉默細胞的T 細胞功能顯著下降［16］。CD69 是早期的白血球活化抗原，反映細胞免疫功能的標志物。正常的T 細胞受TCR/CD3 或CD3/CD28 的刺激時，逐漸地表達于細胞表面，受刺激6 h 開始出現，48 h 達到高峰，其后逐漸減弱，最后消失。表達CD69 需要T 細胞的膜結構和轉導TCR/CD3 信息傳導通路，才能將CD69 蛋白質運輸到細胞膜。用Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)刺激時沉默細胞和對照組細胞表達同等量的CD69，但是用CD3交聯刺激時在沉默細胞中顯著的減少。結果顯示神經鞘磷脂與TCR/CD3 誘導的CD69 表達密切相關［16］。

CD3/TCR 信號活化途徑有經LAT 傳導途徑和經PI3K 傳導途徑兩種。我們轉入Jurkat T 細胞SMS1 的si-RNA 建立SM knockdown 細胞株，用蛋白印跡分析CD3 交聯刺激時ZAP-70 和LAT 及PKCθ的磷酸化，沉默細胞中ZAP-70 和LAT 及PKCθ 的磷酸化比對照細胞明顯地降低。說明細胞膜SM 是筏的重要成分而且在TCR 介導的T 細胞活化過程中發揮重要作用［9］。制備SM 敲除老鼠，用伴刀豆蛋白誘導肝炎時SM 敲除老鼠CD4+T 細胞功能明顯下降［16］。脂質筏鞘磷脂通過CXCL12/CXCR4 途徑減小相應的信號傳遞，調節細胞遷移［17］。

因此SM 與免疫擔當細胞活化或細胞死亡密切相關，臨床上與自身免疫性疾病、變態反應性疾病的免疫異常、細菌或病毒感染性疾病，臟器移植或腫瘤排斥密切相關［18，19］。

6 結語與展望

隨著對脂質筏研究的深入，對細胞膜上的微區結構逐漸清晰，但是仍然存在很多問題需要解決:①脂質筏作為一種膜上微結構是否存在于所有生物膜上?②通過脂質筏的研究能否阻止病原體的入侵?③能否在脂質筏的角度提高腫瘤細胞對腫瘤藥物的敏感性或直接殺死腫瘤細胞?④脂質筏在參與信號轉導機制并不清楚。

近年，生物膜領域細胞膜脂質雙層結構的細胞膜外層和內層脂質分布不均，確立了其非對稱性(asymmetry)正是細胞膜的重要概念。且對生物膜的功能和raft 特性進行比較廣泛的研究。但是，為了更加客觀、更加自然的狀態上觀察空間和時間上變化的細胞膜，期待開發相應的研究方法和工具。因為Raft 的解析也存在技術上有限，對生物化學和生物物理的解析結果的評價存在不同的看法。

今后我們將進一步對①生物膜領域細胞膜脂質雙層結構的細胞膜外層和內層脂質分布不均一性，非對稱性破壞為誘因的免疫細胞功能異常;②SM/神經酰胺平衡的破壞為誘因的細胞的生存和死亡的信號傳導;③SMS1 敲除老鼠的自身免疫性疾病、腫瘤或感染疾病的發生;④利用SM 的調節的方法對免疫抑制劑，抗癌藥物的開發進行解析。

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