IL-17 在類風濕關節炎患者外周血表達的臨床意義

車昌燕 張國華 劉俊平 王明亮 (山西醫科大學汾陽學院，汾陽 032200)

類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種發病機制尚不明確的以關節滑膜慢性炎癥為主的自身免疫性疾病，細胞因子在慢性炎癥過程中起到重要作用［1］。近年來研究發現Th17 是RA 重要的效應T 細胞亞群［2］，而白細胞介素17(Interleukin-17，IL-17)是Th17 細胞產生的一種前炎性細胞因子，在介導炎癥反應、自身免疫性疾病中發揮重要作用［3，4］，可能與RA 炎癥反應、血管新生及關節滑膜病變之間存在一定的聯系。本研究通過從基因和蛋白水平檢測IL-17 在RA 患者和健康對照者外周血的表達并分析其與類風濕因子(RF)的相關性，探討IL-17 與RA 發病及活動性的關系，為RA 的發病機制研究和臨床治療提供新的理論依據。

1 對象與方法

1.1 對象 66 例類風濕關節炎患者均來自山西省汾陽醫院門診或住院病人，均符合1987 年美國風濕病學會(ARA)制定的類風濕關節炎診斷標準，其中男性24 例，女性42 例，年齡27～65 歲，平均(43.7±7.2)歲，疾病的活動性用DAS28 評分來判斷，DAS28 ＞3.2 為活動期組，共34 例;DAS28 ＜3.2 為緩解期組，共32 例。均排除高血壓、糖尿病、肝腎疾病、感染、腫瘤、心腦血管疾病和其他自身免疫性疾病等。對照組為42 例健康體檢者，其中男性14 例，女性28 例，年齡23～66 歲，平均(46.5±7.8)歲。各組患者年齡、性別比較差異無統計學意義，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 標本 采集所有研究對象空腹靜脈血2 管，第一管全血3 ml，置于肝素抗凝管中，用于IL-17 mRNA 的檢測。第二管無抗凝劑3 ml，靜置30 min，3 000 r/min 離心后取血清，分裝后置-70℃保存，用于血清IL-17 及RF 的檢測。

1.2.2 PBMC 中IL-17 mRNA 的檢測 采用密度梯度離心法分離PBMC，用無菌生理鹽水稀釋至細胞濃度為1 ×107ml-1。將分離的PBMC 中加入Trizol，按常規提取總RNA，測OD 值定量，以A260/A280、A260/A230 比值判斷RNA 樣品質量，-70℃冰箱保存備用。根據GenBank 人IL-17 cDNA 序列設計引物，以β-actin 作為內參照。IL-17 (172 bp):上游引物5'-GGCTGGAGAAGATACTGGTGT -3'，下游引物5'-TTTAGTCCGAAATGAGGCTGT-3'。β-actin (600 bp):上游引物5'-CACACTGTGCCCATCTACGA-3'，下 游 引 物 5'-CTGCTTGCTGATCCACATCT-3'。選用TaKaRa 公司的PrimeScript?One Step RT-PCR Kit Ver.2 試劑盒擴增IL-17，通過預實驗確定PCR 反應條件和最適循環數，以保證PCR產物量與起始mRNA 量呈線性相關。反應結束后取5 μl PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像分析儀上觀察拍照，分析電泳條帶的光密度值，以β-actin 作內參照，用相對光密度值［(IL-17 光密度值/β-actin 光密度值)× 100%］代表mRNA 的表達量。

1.2.3 血清IL-17 和RF 的檢測 采用上海森雄科技實業有限公司生產的ABC-ELISA 試劑盒檢測血清IL-17 表達水平，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行，用Bio-Rad 伯樂酶標儀680 于492 nm 波長處測定OD 值，通過繪制標準曲線計算血清中IL-17的濃度。采用OLYMPUS 全自動生化分析儀檢測血清RF 表達水平，所用試劑為原裝配套試劑，檢測正常范圍＜14 U/ml。

1.3 統計學分析 所有數據均采用SPSS11.5 軟件進行統計學分析。數據用±s 表示，兩組間均數比較采用獨立樣本t 檢驗，顯著性水準P ＜0.05，各指標間的相關性檢驗采用Pearson 相關性分析。

2 結果

2.1 RA 患者和健康對照組PBMC 中IL-17 mRNA的表達水平 RT-PCR 結果顯示，健康對照組和RA患者組在172 bp 處都有條帶出現，但在RA 患者組的表達強度明顯高于健康對照組，但RA 活動期和緩解期患者PBMC 中IL-17 mRNA 的平均表達水平無明顯差別(圖1、表1)，差異無統計學意義(P ＞0.05)。

圖1 IL-17 mRNA 的RT-PCR 電泳分析Fig.1 RT-PCR electrophoresis analysis of IL-17 mRNA

表1 IL-17 mRNA 和血清IL-17 的表達水平(±s)Tab.1 Levels of IL-17 mRNA and serum IL-17(±s)

表1 IL-17 mRNA 和血清IL-17 的表達水平(±s)Tab.1 Levels of IL-17 mRNA and serum IL-17(±s)

Note:Compared with healthy control，1)P ＜0.05;compared with inactiveRA，2)P ＞0.05;compared with inactive RA，3)P ＜0.05.

表2 RA 患者體內IL-17 與RF 的相關性分析Tab.2 Correlation analysis of IL-17 and RF in RA patients

2.2 RA 患者和健康對照組血清IL-17 的表達水平 ELISA 結果顯示RA 活動期患者血清IL-17 的表達明顯高于RA 緩解期患者和健康對照組(表1)，差異均有統計學意義(P=0.001)。

2.3 RA 患者血清IL-17 與RF 的相關性 Pearson相關性分析結果顯示:RA 患者血清中IL-17 含量與RF 的表達呈正相關(P ＜0.05)(表2)。

3 討論

類風濕關節炎(RA)是一種累及周身關節為主的自身免疫性疾病，其病理特征是慢性炎癥細胞(T細胞和巨噬細胞)浸潤和多種細胞因子分泌，最終導致關節滑膜漸進性損傷和骨質破壞［1］，其病因及發病機制仍不十分清楚。現在免疫機制越來越受到國內外專家的關注，國內外研究發現RA 患者體內多種細胞因子和炎癥介質異常表達，它們之間通過相互作用，相互調節形成一個復雜的網絡，可能直接或間接參與了RA 的發生和發展過程［5，6］。

IL-17 主要由Th17 細胞產生，是含有一個N-末端信號肽的155 個氨基酸的糖蛋白，是一種重要的前炎性細胞因子，與機體許多炎癥反應和自身免疫性疾病的發生和發展有關。IL-17 能刺激成纖維細胞分泌IL-6、IL-8 和GM-CSF 等炎癥因子，并能抑制軟骨細胞合成基質，增強破骨細胞活性，最終導致骨破壞［7］。有研究顯示在RA 患者關節滑膜及滑膜液中有大量的IL-17 表達［8］，動物實驗也證實在佐劑誘導關節炎模型早期，腹股溝淋巴結中IL-17 表達已升高，膝關節內注射腺病毒IL-17 可促進小鼠膠原性關節炎的發生［9］，阿巴西普(abatacept)是臨床治療RA 的新藥物，已有研究顯示RA 患者經阿巴西普治療后外周血中IL-17 的水平明顯降低［11］，說明IL-17 在RA 的發病中具有重要作用。

DAS28 評分是一種有效地評價RA 疾病活動程度的指標，我們依據DAS28 評分將RA 患者分組，比較兩組間及二者與健康對照組外周血PBMC 中IL-17 mRNA 和血清IL-17 的表達水平，研究結果顯示，與健康對照組相比，RA 患者外周血PBMC 中IL-17 mRNA 和血清IL-17 的表達均顯著升高，提示IL-17 可能作為炎性細胞因子參與了RA 的發病過程。值得注意的是，活動期RA 患者與緩解期RA 患者外周血PBMC 中IL-17 mRNA 的表達無明顯差別，但活動期RA 患者血清IL-17 的表達顯著高于緩解期RA 患者，可能是在活動期RA 患者體內某些因素激發了IL-17 mRNA 的表達，導致血清IL-17 水平的增高，表明血清IL-17 的表達水平與RA 的疾病活動性有關，但具體作用機制有待進一步研究。Pearson 相關性分析顯示血清IL-17 表達水平與RF 表達成正相關，表明IL-17 可能是導致RA 炎癥發展和骨破壞的重要因素，通過檢測IL-17 可以間接觀察RA進展和疾病活動程度，為臨床用藥提供理論依據。

IL-17 有多種生物學作用，因此其參與RA 發病的機制也可能是多方面的，進一步深入研究IL-17與RA 的關系，將有助于對RA 發病機制的進一步認識，合理地評價RA 的病情進展，為RA 的臨床診治提供新的思路。

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