HE4 兩種融合蛋白的基因構建和原核表達

張雪峰 劉一兵 李子穎 賈娟娟 王 斌 韓世泉

(原子高科股份有限公司，北京 102413)

卵巢癌是女性生殖器官常見的腫瘤之一，是嚴重威脅婦女生命和健康的疾病，其死亡率高于其他任何女性生殖系統腫瘤。70%以上卵巢癌病例就診時已為晚期，而晚期患者長期生存率不超過25%［1，2］。如果卵巢癌患者能在早期被診斷、治療，其預后則非常理想。在Ⅰ期獲得診斷的卵巢癌，90%以上可通過手術和化療來治療且可達很好效果，但目前僅25%卵巢癌可以在Ⅰ期被發現。其中一方面原因是卵巢癌缺乏特異性的病狀體征，另一方面是缺乏有效的篩查方法。因此，提高卵巢癌的早期診斷水平、監測其治療效果一直以來都是臨床醫生關注的熱點。

目前臨床上廣泛采用CA125 作為卵巢癌篩查和診斷的腫瘤標志物，它對卵巢惡性腫瘤的早期診斷和病情監測等有一定意義，但其臨床特異性及臨床靈敏度卻不夠理想。CA125 在癌癥早期表達的陽性率僅為50%～60%，即使在中晚期卵巢腫瘤中也只有70%～80%［3，4］，2000 年，Hough 等［5］應用基因表達大規模序列分析法證實HE4 基因是一種與卵巢癌相關的表達差異基因，提示HE4 可能作為新一代的卵巢癌診斷標志物。2003 年，Hellstrom［6，7］及其同事從卵巢癌細胞OVCAR-3 中提取RNA，經逆轉錄及擴增獲得HE4 基因，并開展了一系列的后續研究。目前的研究表明，人附睪蛋白4(Human epididymis protein 4，HE4)作為新近提出的卵巢癌腫瘤標志物，它在卵巢癌組織中高表達，而在癌旁組織、正常組織及良性腫瘤中水平較低［8］，檢測HE4 可能有助于卵巢惡性腫瘤的診斷、監測及療效評估等［9，10］。本實驗采用原核表達作為表達系統，對重組蛋白進行誘導表達，為將來進一步開發HE4 免疫分析診斷試劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、質粒和菌株 人卵巢透明癌細胞ES-2購自中國醫學科學院基礎醫學研究所，pEASY-Blunt Simple 克隆載體、Trans10 菌株和E.coli BL21 菌株購自北京全式金生物技術有限公司。PET26b 和pGEX-4T-1 載體為本實驗室保存。

1.2 工具酶和主要試劑 Trizol 試劑、DMEM 培養基購自Sigma 公司。限制性內切酶EcoR Ⅰ、XhoⅠ、T4 連接酶購自NEB 公司。RT-PCR 試劑盒、DNA 純化試劑盒購自Promega 公司。凝膠回收試劑盒購自TaKaRa 公司。GST 層析柱填料和鎳層析柱填料均購自GE 公司。引物合成與測序由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成，引物序列為P1:5'-ACTGAGAATTCATGCCTGCTTGTCGCC-3'(含EcoRⅠ酶切位點)和P2:5'-ATGCTCTCGAGTCAGAAATTGGGAGTGAC-3' (含Xho Ⅰ酶切位點)［11］。胎牛血清購自北京依科賽生物制品有限公司。HE4 酶聯免疫分析試劑盒購自Fujirebio Diagnostis 公司。其他主要試劑均為國產分析純。

1.3 細胞培養及RNA 提取 在5%CO2、37℃條件下，采用含10%胎牛血清的DMEM 培養基培養人卵巢透明癌ES-2 細胞株，待細胞生長至對數生長期時采用Trizol 法提取細胞總RNA。

1.4 RT-PCR 擴增HE4 基因 采用Promega RTPCR 試劑盒，按照說明書步驟進行逆轉錄。PCR 反應體積為20 μl，其中2×Taq 聚合酶混合物10 μl、cDNA 3 μl、上下游引物各0.5 μl、滅菌水6 μl。PCR 反應條件為:94℃預變性5 min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進行30 次循環;最后72℃延伸6 min。PCR 產物經1%瓊脂糖電泳驗證，并用凝膠回收試劑盒回收PCR 產物。

1.5 HE4 基因重組克隆質粒的構建 將獲得的4 μl PCR 產物與1 μl pEASY-Blunt 載體質粒連接構建pEASY-Blunt-HE4 質粒，轉化進入感受態Trans10細菌中，均勻涂布于準備好的含氨芐霉素抗性LB平板培養基上，IPTG 誘導，X-Gal 作為生色劑，過夜培養。挑取白色菌落擴大培養，取部分菌液并行抽提質粒進行雙酶切及測序鑒定。

1.6 HE4 基因重組表達質粒的構建 利用PET26b和pGEX-4T-1 質粒分別作為載體構建原核表達載體，采用限制性內切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ分別雙酶切pEASY-Blunt-HE4 質粒、PET26b 和pGEX-4T-1。將凝膠回收得到的HE4 片段分別插入到酶切后的PET26b 和pGEX-4T-1 中。將重組質粒PET26b-HE4 和pGEX-4T-1-HE4 分別轉化入感受態表達菌E.coli BL21 中，涂布于分別含有相應抗性的LB 平板培養基上。過夜培養后，取菌液抽提質粒進行雙酶切和測序鑒定。

1.7 HE4 融合蛋白的表達 分別對鑒定正確的PET26b-HE4 和PGEX-4T-1-HE4 進行誘導表達。取菌液進行擴大培養，待OD600nm 值達0.6～0.8 時加入IPTG 至終濃度為0.5 mmol/L，37℃誘導4 h，離心收集菌體，磷酸鹽緩沖液重懸菌體，經超聲波破碎后，分別收集上清和沉淀，進行12% SDS-PAGE分析。

1.8 表達產物的純化 按照1.7 項大量誘導表達重組蛋白，取菌液，12 000 r/min 離心30 min，棄上清，將沉淀重懸于含0.5% TritonX-100、2.5 mmol/L二硫蘇糖醇、1.25 mmol/L L-半胱氨酸的平衡緩沖液中，4℃超聲裂解，收集可溶性蛋白，分別對GSTHE4 和His-HE4 使用GST 親和層析柱和鎳析柱進行純化，洗脫、透析后，進行12% SDS-PAGE 分析。

1.9 重組蛋白活性鑒定 采用HE4 酶聯免疫分析試劑盒對表達蛋白進行活性鑒定。將表達蛋白His-HE4 和GST-HE4 分別進行稀釋，依照試劑盒說明書對兩種表達蛋白進行測定。

2 結果

2.1 HE4 基因擴增產物的鑒定 以卵巢癌細胞總RNA 為模板，經RT-PCR 擴增出大小約為400 bp 的特異條帶，與預期相符，見圖1。

圖1 HE4 基因PCR 擴增產物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of HE4 gene

2.2 重組克隆質粒的鑒定 重組克隆質粒pEASYBlunt-HE4 的雙酶切(EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ)產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約400 bp 的目的基因條帶，見圖2。測序結果表明重組克隆質粒構建正確。

2.3 重組表達質粒的鑒定 重組表達質粒PET26b-HE4 和PGEX-4T-1-HE4 的雙酶切(EcoRⅠ/Xho Ⅰ)產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約400 bp 的目的基因條帶，見圖3。測序結果表明重組表達質粒構建正確。

2.4 表達產物的鑒定 重組菌PGEX-4T-1-HE4 的誘導表達產物經12% SDS-PAGE 分析，可見相對分子量約38 000 的特異蛋白條帶，重組蛋白GST-HE4主要以包涵體形式存在于破碎后的沉淀中，見圖4。重組菌PET26b-HE4 的誘導表達產物經12% SDSPAGE 分析，在相對分子量約12 000 處無明顯特異條帶，提示表達產量較低，圖略。

圖2 重組克隆質粒的雙酶切(EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ)鑒定Fig.2 Restriction map of recombinant plasmid pEASYBlunt-HE4(EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ)

圖3 兩種重組表達質粒的雙酶切(EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ)鑒定Fig.3 Restriction map of recombinant plasmid PGEX-4T-1-HE4(EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ)and PET26b-HE4(EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ)

2.5 純化產物的鑒定 純化產物GST-HE4 經12%SDS-PAGE 分析，在相對分子量約38 000 處可見明顯的特異性條帶，見圖5。純化重組蛋白GST-HE4的純度約為50%。

純化產物His-HE4 經12% SDS-PAGE 分析，在相對分子量約12 000 處可見蛋白條帶，見圖6。純化重組蛋白His-HE4 的純度小于10%。

2.6 重組蛋白的活性鑒定 采用HE4 進口酶聯免疫分析試劑盒對重組蛋白GST-HE4 和His-HE4 進行活性鑒定，結果顯示，商品化試劑盒的兩株單克隆抗體可以特異識別表達產物GST-HE4 和His-HE4，并形成包被抗體-抗原-標記抗體復合物。經測定，純化產物GST-HE4 濃度為1.0 mg/ml，純化產物His-HE4 濃度為15 μg/ml。

圖4 GST-HE4 表達產物的SDA-PAGE 分析Fig.4 SDS-PAGE profile of expressed GST-HE4 fusion protein

圖5 純化產物GST-HE4 的SDS-PAGE 分析Fig.5 SDS-PAGE profile of purified GST-HE4 fusion protein

圖6 純化產物His-HE4 的SDS-PAGE 分析Fig.6 SDS-PAGE profile of purified His-HE4 fusion protein

3 討論

HE4 作為一種新型的腫瘤標志物，在臨床上已逐漸應用于對卵巢癌的診斷及術后療效評估過程之中。本實驗采用具有相同限制性酶切位點的兩種表達質粒分別構建了pGEX-4T-1-HE4 和PET26b-HE4兩種原核表達系統，并分別獲得了GST-HE4 和His-HE4 兩種原核表達蛋白。實驗結果顯示，重組蛋白GST-HE4 在表達水平和表達蛋白可溶性方面要優于His-HE4，且更易于純化。

原核表達HE4 蛋白相對分子量約為12 kD，而血清樣品中天然HE4 相對分子量約為20～25 kD，這是由于人體內HE4 蛋白表達后糖基化修飾所致［12］。本實驗采用酶聯免疫分析試劑盒鑒定表達蛋白活性，實驗結果顯示表達蛋白GST-HE4 和His-HE4 均可被商用試劑盒的兩株單克隆抗體識別。這說明原核表達蛋白盡管在糖基化修飾方面存在缺點，但仍存在折疊正確的抗原表位，并且可與HE4單克隆抗體發生特異性結合。

在未來的工作中，本實驗獲得的原核表達蛋白將可用于HE4 單克隆抗體制備以及作為校準品建立免疫分析方法。在抗體制備過程中，可采用純度相對較高的GST-HE4 作為免疫原進行小鼠免疫，而采用His-HE4 對雜交瘤細胞進行篩選。兩種表達蛋白同時使用，將有利于篩選得到針對HE4 的特異性單克隆抗體。

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