小兒健脾散中黃芪甲苷、歐前胡素和異歐前胡素的含量測定方法探索*

郭 琪，李向陽，宋漢敏

(河南省食品藥品檢驗所，河南 鄭州450003)

小兒健脾散(曾用名:娃娃寶)為中華人民共和國衛生部藥典委員會于1991 年出版發行的《中華人民共和國衛生部藥品標準:中藥成方制劑》第三冊收載品種。該方是由黨參、石蓮子、木香、廣藿香、茯苓、白芷、黃芪、白扁豆、六神曲和甘草等10 味藥材組成的復方散劑，有益氣健脾、和胃運中之功效，臨床多用于脾胃虛弱、脘腹脹滿、嘔吐泄瀉、不思飲食的兒童。該方原質量標準中僅有顯微鑒別和理化鑒別等定性質控方法。為全面控制該藥的內在質量和保障用藥安全，本研究采用高效液相法對小兒健脾散中的重要藥物——黃芪、白芷分別以主要成分黃芪甲苷［1-2］和歐前胡素、異歐前胡素［3］為指標，進行了含量測定研究。

1 藥品、試劑與儀器

小兒健脾散，廣西來賓金錢草藥業有限公司產品，批號090902。黃芪甲苷對照品(批號110781 -200613)、歐前胡素(批號110826 -200511)、異歐前胡素(批號110827 -200407)，均由中國食品藥品檢定研究院提供;乙腈、甲醇，均為色譜純，德國Merck公司產品;超純水為自制水。Waters 高效液相色譜儀(2695 溶劑管理系統，2996 二極管陣列檢測器，美國Waters 柱溫箱，Empower 2 工作站)，產地美國;ELSD 2000ES 蒸發光散射檢測器，美國Alltech 公司產品;AE240 十萬分之一電子分析天平，瑞士METTLER 公司產品;Advantage A10 超純水凈化儀，美國MILLIPORE 公司產品。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備

對照品溶液Ⅰ的制備:取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每毫升含99 μg 的溶液，即得。對照品溶液Ⅱ的制備:取歐前胡素、異歐前胡素對照品適量，加甲醇制成每毫升含歐前胡素30.4 μg、異歐前胡素27.5 μg 的混合溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備

供試品溶液Ⅰ的制備(用以分析黃芪甲苷):取本品約5 g，精密稱定，置索氏提取器中;加甲醇適量，加熱回流提取5 h;提取液回收甲醇并濃縮至干;殘渣加水10 mL，微熱使溶解;用乙醚振搖洗滌2 次，每次20 mL;棄去乙醚液，水溶液再用水飽和的正丁醇振搖提取4 次，每次20 mL;合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌2 次，每次10 mL;棄去氨液，正丁醇液再用正丁醇飽和的水振搖洗滌2 次，每次10 mL;正丁醇液回收溶劑至干;殘渣加甲醇溶解，轉移至10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度;搖勻，濾過，取續濾液，即得。

供試品溶液Ⅱ的制備(用以分析歐前胡素、異歐前胡素):取本品約5 g，精密稱定，置索氏提取器中;加乙醚適量;加熱回流提取5 h;提取液低溫回收乙醚并濃縮至干;殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度;搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液的制備

缺黃芪陰性樣品溶液的制備(用以分析黃芪甲苷):依處方量制備缺黃芪的陰性樣品，按供試品溶液Ⅰ的制備方法制成相應的陰性樣品溶液Ⅰ，備用。

缺白芷陰性樣品溶液的制備(用以分析歐前胡素、異歐前胡素):依處方量制備缺白芷的陰性樣品，按供試品溶液Ⅱ的制備方法制成相應的陰性樣品溶液Ⅱ，備用。

2.2 色譜條件

2.2.1 色譜條件Ⅰ

此色譜條件用以分析黃芪甲苷。采用Phenomenex Luna C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，柱溫35 ℃，流動相為乙腈- 水 (35 ∶65)，流速1.0 mL/min，載氣流速2.3 L/min，蒸發光散射檢測器漂移管溫度105 ℃。

2.2.2 色譜條件Ⅱ

此色譜條件用以分析歐前胡素、異歐前胡素。采用Phenomenex Luna C18柱(4. 6 mm ×250 mm，5 μm)，柱溫30℃，流動相為甲醇-水(60∶40)，流速1.0 mL/min，檢測波長310 nm。

2.3 專屬性考察

分別精密吸取上述溶液適量注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果見圖1、圖2。結果表明:供試品色譜中，在與對照品色譜峰相應的位置上，均具有相同保留時間的色譜峰，而相應的陰性溶液在相應保留時間處無干擾，方法的專屬性良好。

圖1 小兒健脾散黃芪甲苷項HPLC-ELSD 色譜圖

圖2 小兒健脾散歐前胡素、異歐前胡素HPLC 色譜圖

2.4 標準曲線與線性范圍

分別精密吸取黃芪甲苷對照品溶液和歐前胡素、異歐前胡素混合對照品溶液各2，5，10，15，20 μL，分別在色譜條件Ⅰ、Ⅱ依次進樣，記錄色譜圖。黃芪甲苷以峰面積(Y)的自然對數為縱坐標，以對照品進樣量(X)的自然對數為橫坐標，繪制標準曲線;歐前胡素、異歐前胡素以峰面積(Y)為縱坐標，以對照品進樣量(X)為橫坐標，繪制標準曲線，結果見表1。

表1 3 個成分的標準曲線方程、相關系數和線性范圍

2.5 精密度試驗

精密吸取供試品溶液Ⅰ、Ⅱ各10 μL，分別在色譜條件Ⅰ、Ⅱ下，連續進樣6 次，記錄峰面積。結果:黃芪甲苷、歐前胡素、異歐前胡素的RSD 值(n =6)分別為0.17%、0.59%、0.88%。結果表明:儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

選取同一批次小兒健脾散，分別參照供試品溶液Ⅰ、Ⅱ的制備方法平行制備6 份供試品溶液，分別在色譜條件Ⅰ、Ⅱ下進樣10 μL，記錄峰面積，計算含量及RSD 值。黃芪甲苷、歐前胡素、異歐前胡素的平均含量(n=6)依次為0.120 ，0.059，0.037 mg/g，RSD 值分別為1.80%、1.24%、1.62%。

2.7 穩定性試驗

取供試品溶液Ⅰ、Ⅱ各1 份，分別在色譜條件Ⅰ、Ⅱ下，在第0，2，4，6，10 h 注入液相色譜儀，每次進樣10 μL，測定各待測成分的峰面積并計算RSD值。結果:黃芪甲苷、歐前胡素、異歐前胡素的RSD值分別為0.43%、0.69%、0.97%。結果表明:供試品溶液Ⅰ、Ⅱ在10 h 內均穩定。

2.8 加樣回收率試驗

將已知含量的樣品(廣西來賓金錢草藥業有限公司，批號090902，黃芪甲苷、歐前胡素和異歐前胡素含量分別為0.120 ，0.059 ，0. 037 mg/g)分為2 組，每組6 份，每份約2.5 g，精密稱定;第1 組置索氏提取器中，精密加入含黃芪甲苷對照品溶液(99 mg/L)3 mL，按供試品溶液Ⅰ制備方法制備加樣供試品溶液;第2 組亦置索氏提取器中，精密加入歐前胡素對照品溶液(30.4 mg/L)5 mL 及異歐前胡素對照品溶液(27.5 mg/L)3 mL(回流提取前先蒸去甲醇)，按供試品溶液Ⅱ制備方法制備加樣供試品溶液。精密吸取對照品溶液與供試品溶液，分別在色譜條件Ⅰ、Ⅱ下依次注入液相色譜儀，測定黃芪甲苷、歐前胡素及異歐前胡素的含量，計算回收率。結果見表2。

表2 黃芪甲苷、歐前胡素、異歐前胡素回收率試驗結果

2.9 檢測限和定量限的測定

取對照品溶液，分別在色譜條件Ⅰ、Ⅱ下按濃度稀釋法進樣分析，測定色譜系統基線噪音。以信噪比3∶1為檢測限，信噪比10∶1為定量限。經檢測，黃芪甲苷檢測限為0.09 ng，定量限為0.29 ng;歐前胡素檢測限為0.1 ng，定量限為0.3 ng;異歐前胡素檢測限為0.28 ng，定量限為0.82 ng。

2.10 耐用性試驗

取2.1.2 項下供試品溶液Ⅰ、Ⅱ，分別按照色譜條件Ⅰ、Ⅱ，依次使用Phenomenex Luna C18柱、CHROM-MATRIX C18柱和Agilent ZORBAX SB-C18柱，測定供試品溶液中黃芪甲苷、歐前胡素和異歐前胡素的含量。結果:三者的RSD 值分別為1.9%、1.1%、2.3%。結果表明:不同品牌的色譜柱對該方法耐用性良好。

3 討 論

3.1 黃芪供試品溶液的制備方法研究

黃芪藥材在處方中所占比例較低，需要較大取樣量，因此選擇索氏提取法制備供試品溶液。在實驗中，比較了不同的提取時間和萃取次數，結果索氏提取5 h、正丁醇萃取4 次即可將黃芪甲苷提取完全，回收率符合規定，而乙醚洗滌除雜效果明顯優于三氯甲烷，因此選用乙醚洗滌除雜的方法制備黃芪甲苷含測供試品溶液。試驗中也嘗試通過D101 大孔樹脂柱除雜，但發現黃芪甲苷含量下降明顯，而萃取除雜也可取得較為理想的結果。在供試品提取過程中，氨試液洗滌的靜置時間長短對黃芪甲苷含量有較大的影響，通過實驗確定每次氨洗后靜置時間在2 h 以上時，黃芪甲苷可提取完全且含量穩定［4-5］。

3.2 白芷供試品溶液的制備方法研究

預實驗發現:乙醚提取物中含有白芷的特征成分歐前胡素和異歐前胡素，且雜質明顯少于甲醇超聲提取物。有研究發現:小兒健脾散由乙醚索氏提取5 h 后，濃縮后制成白芷含測的供試品溶液，進樣測定，可取得滿意結果［6-7］。

黃芪甲苷是黃芪的主要有效成分和質控指標，由于黃芪甲苷紫外吸收較弱，本文采用與2010 版《中國藥典》(一部)黃芪含測項下一致的HPLCELSD 法對小兒健脾散中黃芪甲苷含量進行檢測。歐前胡素和異歐前胡素是白芷的特征成分。本研究利用高效液相色譜法以此3 個成分在小兒健脾散中的含量為指標進行測定，結果表明，該法操作簡便、測定結果精確、重復性好、特征性強，能夠有效控制該藥的質量，并為保障用藥的合理性及保證臨床用藥的有效性提供了一定的科學依據。

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