高鋅抑制鼠前列腺癌細胞RM?1侵襲與誘導凋亡的實驗研究

王波，汲坤，張麗艷，尚德志，李璞宸，劉璐璐

（1.內蒙古民族大學第二臨床醫學院病理科，內蒙古民族大學分子病理學研究所，內蒙古林業總醫院病理科，內蒙古牙克石022150；2.沈陽醫學院病理生理學教研室，沈陽110034；3.沈陽醫學院頜面外科，沈陽110034；4.沈陽醫學院2011級醫學影像學，沈陽110034）

高鋅抑制鼠前列腺癌細胞RM?1侵襲與誘導凋亡的實驗研究

王波1，汲坤2，張麗艷2，尚德志3，李璞宸4，劉璐璐4

（1.內蒙古民族大學第二臨床醫學院病理科，內蒙古民族大學分子病理學研究所，內蒙古林業總醫院病理科，內蒙古牙克石022150；2.沈陽醫學院病理生理學教研室，沈陽110034；3.沈陽醫學院頜面外科，沈陽110034；4.沈陽醫學院2011級醫學影像學，沈陽110034）

目的探討鋅對鼠前列腺癌細胞RM?1侵襲能力和凋亡的影響。方法將RM?1細胞培養于含Zn2+的培養基中，Zn2+終濃度分別為0 μmol/L（control）、100 μmol/L、200 μmol/L、250 μmol/L、300 μmol/L，繼續培養24 h，MTT檢測鋅對RM?1細胞增殖的影響；RT?PCR檢測腫瘤侵襲和凋亡相關基因mmp?2、mmp?9、bax和bcl?2mRNA表達。結果MTT檢測結果顯示，與對照組比較，不同濃度鋅對RM?1細胞增殖抑制率明顯增加（P＜0.05）；與100 μmol/L組、200 μmol/L組比較，250 μmol/L組、300 μmol/L組細胞增殖抑制率明顯增加（P＜0.01）。RT?PCR結果顯示，與對照組比較，250 μmol/L、300 μmol/L組mmp?2和mmp?9mRNA及bcl?2mRNA表達水平明顯降低（P＜0.01）；baxmRNA表達水平明顯升高（P＜0.01）。結論高鋅可以降低RM?1細胞的增殖和侵襲能力，誘導RM?1細胞的凋亡。

鋅；前列腺癌；基質金屬蛋白酶；凋亡

前列腺癌（prostate carcinoma，PCa）是男性生殖系統中最常見的惡性腫瘤，其發病率和死亡率呈逐年上升趨勢［1］。正常人前列腺組織中鋅的含量遠較其他組織高，前列腺癌組織中鋅的濃度明顯低于正常前列腺組織和前列腺增生組織［2］。在前列腺癌篩查中，鋅可作為輔助診斷的指標之一［3］。目前鋅在前列腺癌發生發展中的作用越來越受到關注，但具體的作用機制還不明確。本研究應用鋅作用于鼠前列腺癌RM?1細胞株，觀察其對腫瘤細胞的增殖和侵襲能力以及凋亡的影響，為深入研究鋅在前列腺癌及前列腺癌發病相關基因中的作用機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠前列腺癌細胞株RM?1購自上海細胞所。IMDM培養基和胰蛋白酶購自Hyclone公司，胎牛血清和Trizol購自Invitrogen公司，MTT和DMSO購自Sigma公司，M?MuLV和dNTP購自Promega公司。TaqDNA聚合酶購自TaKaRa公司，ZnSO4·7H2O為國產AR級，引物由上海生工生物工程技術服務公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：小鼠前列腺癌細胞株RM?1培養于含10%胎牛血清的IMDM培養液中，置于5%的CO2、37℃恒溫孵箱中培養。待細胞生長達到80%融合時，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化，傳代，更換新鮮的含10%胎牛血清的IMDM培養基，傳代比率為1∶2或1∶3。

1.2.2 MTT比色法檢測細胞活力：取對數生長期的RM?1細胞，以每孔4×104細胞接種于96孔板中，每孔體積200 μL，放入培養箱中孵育24 h后，每組加入含不同濃度Zn2+培養液200 μL。每組6復孔，鋅的終濃度分別為0 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、250 μmol/L、300 μmol/L，培養20 h后每孔加入MTT溶液（5 mg/ml）20 μL，于培養箱中繼續培養4 h，出現藍色結晶后棄孔內液體，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩10 min，用酶標儀檢測波長570 nm時各孔的吸光度值，每組6孔數據取平均值，按下列公式計算細胞存活率。

細胞存活率（%）=實驗組光密度值/對照組光密度值×100%

1.2.3 RT?PCR檢測RM?1細胞中mmp?2、mmp?9、bax和bcl?2mRNA的表達：取對數生長期的RM?1細胞，Zn2+分為0 μmol/L、250 μmol/L、300 μmol/L 3組，于作用24 h后收集細胞。加入Trizol抽提總RNA，逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板，分別用mmp?2、mmp?9、bax、bcl?2及GAPDH的引物進行PCR擴增，取PCR產物進行電泳，采用天能凝膠成像系統拍照并分析條帶灰度，實驗重復3次。引物序列如表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 The sequence of primers for PCR

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 不同濃度鋅對RM?1細胞增殖活力的影響

MTT結果顯示：與對照組比較，100 μmol/L Zn2+作用后RM?1細胞增殖抑制率增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與對照組比較，200 μmol/L、250 μmol/L、300 μmol/L作用后RM?1細胞增殖抑制率明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與100 μmol/L、200 μmol/L Zn2+組比較，250 μmol/L、300 μmol/L Zn2+作用后RM?1細胞增殖抑制率明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.01），見表2。

表2 MTT法檢測不同劑量鋅對RM?1細胞增殖的影響（n=6± s）Tab.2 The survival rate of RM?1 cells after treated with different concentration of zinc（n=6±s）

表2 MTT法檢測不同劑量鋅對RM?1細胞增殖的影響（n=6± s）Tab.2 The survival rate of RM?1 cells after treated with different concentration of zinc（n=6±s）

1）P＜0.05；2）P＜0.01 vs control group.3）P＜0.01 vs 100 μmol/L and 200 μmol/L Zn2+group.

?

2.2 鋅作用后RM?1細胞中腫瘤侵襲相關基因mmp?2和mmp?9mRNA表達的變化

與對照組比較，250 μmol/L、300 μmol/L Zn2+作用后RM?1細胞中mmp?2和mmp?9mRNA的表達明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.01）。見圖1和表3。

圖1 鋅作用后RM?1細胞中mmp?2和mmp?9mRNA的表達Fig.1 The expression of mmp?2 and mmp?9 mRNA in RM?1 cells after zinc treatment

2.3 鋅作用后RM?1細胞中腫瘤凋亡相關基因Bax和Bcl?2mRNA的表達的變化

表3 各組RM?1細胞中mmp?2和mmp?9mRNA的表達水平（n= 3Tab.3 The expression levels of mmp?2 and mmp?9 mRNA in RM?1 cells of different groups（n=3

表3 各組RM?1細胞中mmp?2和mmp?9mRNA的表達水平（n= 3Tab.3 The expression levels of mmp?2 and mmp?9 mRNA in RM?1 cells of different groups（n=3

1）P＜0.01 vs control group.

與對照組比較，250 μmol/L、300 μmol/L Zn2+作用后RM?1細胞中BaxmRNA表達明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與對照組比較，250 μmol/L、300 μmol/L Zn2+作用后RM?1細胞中Bcl?2mRNA表達明顯下降，差異具有統計學意義（P＜0.01）。見圖2和表4。

圖2 鋅作用后RM?1細胞中Bax和Bcl?2mRNA的表達水平Fig.2 The expression of Bax and Bcl?2mRNA in RM?1 cells after zinc treatment

表4 各組RM?1細胞中Bax和Bcl?2mRNA的表達水平（n=3，Tab.4 The expression levels of Bax and Bcl?2 mRNA in RM?1 cells of different groups（n=3

表4 各組RM?1細胞中Bax和Bcl?2mRNA的表達水平（n=3，Tab.4 The expression levels of Bax and Bcl?2 mRNA in RM?1 cells of different groups（n=3

1）P＜0.01 vs control group

3 討論

在美國前列腺癌占男性惡性腫瘤的首位，死亡率居第二位［4］。在中國近年來也呈逐年上升趨勢，上海市市區前列腺癌發病率1989年至2009年20年間前列腺癌發病率增長10余倍；北京市前列腺癌發病率由2001年的5.53/10萬上升至2010年的16.62/ 10萬；吉林大學前列腺疾病防治中心進行的長春50歲以上男性前列腺癌集團篩查也證實前列腺癌發病率的上升趨勢［5］。

鋅是人體必需的微量元素，參與人體內多種酶的構成，在核酸代謝、細胞復制、免疫活性、組織修復和生長方面起重要作用。流行病學調查顯示，前列腺癌與組織內低鋅含量密切相關［6，7］，前列腺組織低鋅含量與PSA生化復發密切相關［8］。在前列腺癌診斷后，經過中位周期6.4年的觀察，高鋅飲食攝入可以降低前列腺癌特異死亡率，但是與鋅有關的前列腺癌生存期延長的機制不明［9］。另有研究發現血清鋅含量在前列腺癌治療前后明顯不同。

侵襲與轉移是前列腺癌患者的致死原因之一，腫瘤細胞的侵襲和轉移潛能與其產生MMPs的能力密切相關。MMPs特別是mmp?2和mmp9的表達升高與前列腺癌遠處轉移和淋巴結侵襲密切相關。在前列腺癌動物模型中應用MMPs合成抑制劑，可以減少腫瘤的生長和延長動物的生存時間［10］。另有研究表明鋅可以誘導腫瘤細胞的壞死和凋亡［11］。

本實驗應用MTT檢測鋅作用后前列腺癌細胞的增殖活性結果表明鋅明顯抑制了前列腺癌細胞的增殖活性。RT?PCR結果顯示，鋅明顯抑制了腫瘤侵襲相關基因mmp?2和mmp?9mRNA的表達；鋅增強了凋亡相關基因Bax的表達，抑制了Bcl?2的表達。上述結果表明鋅可以抑制前列腺癌的增殖和侵襲以及誘導前列腺癌細胞的凋亡。因此只有理解鋅抗腫瘤的基礎機制后，才能正確和有效的將其運用到腫瘤的治療中。我們將在后期研究中進一步明確鋅在前列腺癌發生發展中的作用機制，為最終通過鋅制劑的干預來預防早期前列腺癌的發生、發展以及減少手術后的前列腺癌患者復發提供實驗依據。

［1］Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2012［J］.CA Cancer J Clin，2012，62（1）：10-29.

［2］Tsuchiya N，Ohyama C，Habuchi T.Tumor markers in prostate can?cer?clinical significance and future prospect of prostate specific anti?gen（PSA）［J］.Gan To Kagaku Ryoho，2005，32（2）：275-280.

［3］李曉萌，李江，張靈，等.血清鋅在前列腺癌篩查中的意義［J］.中國實驗診斷學，2006，10（2）：132-135.

［4］Siegel R，Ward E，Brawley O，et al.Cancer statistics，2011：the im?pact of eliminating socioeconomic and racial disparities on prema?ture cancer deaths［J］.CA Cancer J Clin，2011，61（4）：212-236.

［5］張靈，計國義，李曉萌，等.前列腺癌集團檢診對臨床前列腺癌診斷的影響［J］.中華泌尿外科雜志，2004，25（2）：103-105.

［6］汲坤，張靈，邵月婷，等.前列腺癌患者血清中銅、鋅與銅/鋅比值的變化及意義［J］.中國男科學雜志，2007，21（5）：9-14.

［7］Franklin RB，Feng P，Milon B，et al.hZIP1 zinc uptake transporter down regulation and zinc depletion in prostate cancer［J］.Mol Can?cer，2005，4：32.

［8］Sarafanov AG，Todorov TI，Centeno JA，et al.Prostate cancer out?come and tissue levels of metal ions［J］.Prostate，2011，71（11）：1231-1238.

［9］Epstein MM，Kasperzyk JL，Andren O，et al.Dietary zinc and pros?tate cancer survival in a Swedish cohort［J］.Am J Clin Nutr，2011， 93（3）：586-593.

［10］Lein M，Jung K，Ortel B，et al.The new synthetic matrix metallopro?teinase inhibitor（Roche 28?2653）reduces tumor growth and pro?longs survival in a prostate cancer standard rat model［J］.Onco?gene，2002，21（13）：2089-2096.

［11］Iitaka M，Kakinuma S，Fujimaki S，et al.Induction of apoptosis and necrosis by zinc in human thyroid cancer cell lines［J］.J Endocri?nol，2001，169（2）：417-424.

（編輯 裘孝琦）

Zinc Inhibits Invasion and Induces Apoptosis of RM?1 Cells in vitro

WANG Bo1，JI Kun2，ZHANG Li?yan2，Shang De?zhi3，LI Pu?chen4，LIU Lu?lu4
（1.Department of Pathology，The Second Clinical Medical School of Inner Mongolia University for the Nationalities；Molecular Pathological Research Institute of Inner Mongolia University for Nationalities；Department of Pathology，Inner Mongolia Forestry General Hospital，Yakeshi 022150，China；2.Department of Pathophysiology，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；3.Department of Maxillofacial Surgery，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；4.Grade 2011 medicalimaging，Shenyang MedicalCollege，Shenyang110034，China）

ObjectiveTo investigate the effects of zinc on the invasion and apoptosis of RM?1 cells.MethodsThe RM?1 cells were exposed to differentconcentration ofzinc for24 h.MTT was used to detectthe proliferation rate ofRM?1cells.RT?PCRwas used to detectthe mRNA expression of invasion and apoptosis?related genes includingmmp?2，mmp?9，baxandbcl?2.ResultsCompared with control group，the proliferation rates of RM?1 cells in different concentration of zinc groups were lower（P＜0.05）.Compared with 100 μmol/L and 200 μmol/L groups，the proliferation rates of RM?1 cells in 250 μmol/L and 300 μmol/L groups were significantly inhibited（P＜0.01）.Compared with control group，the expression ofmmp?2，mmp?9andbcl?2mRNAs were decreased and the expression ofbaxmRNA was significantly increased in 250 μmol/L and 300 μmol/L groups（P＜0.01）.ConclusionZinc can inhibit proliferation and invasion，and induce apoptosis of RM?1 cells.

zinc；prostate cancer；matrix metalloproteinase；apoptosis

R73

A

0258-4646（2014）07-0589-03

國家自然科學基金（81260310）；遼寧省博士科研啟動基金（20111126）；沈陽醫學院科技發展基金（20113069）

王波（1976-），男，副主任醫師，博士.

汲坤，E-mail：jikun0629@gmail.com

2014-05-22

網絡出版時間：