蟾毒靈通過下調AKT的活性誘導乳腺癌MCF?7細胞凋亡

閆順朝，劉云鵬，曲秀娟，焦昕，李凱，李午生，鄒華偉

（1.中國醫科大學附屬盛京醫院第一腫瘤科，沈陽110022；2.中國醫科大學附屬第一醫院腫瘤內科，沈陽110001；3.沈陽市胸科醫院呼吸一科，沈陽110044）

蟾毒靈通過下調AKT的活性誘導乳腺癌MCF?7細胞凋亡

閆順朝1，劉云鵬2，曲秀娟2，焦昕3，李凱1，李午生1，鄒華偉1

（1.中國醫科大學附屬盛京醫院第一腫瘤科，沈陽110022；2.中國醫科大學附屬第一醫院腫瘤內科，沈陽110001；3.沈陽市胸科醫院呼吸一科，沈陽110044）

目的研究蟾毒靈（Bufalin）對乳腺癌MCF?7細胞增殖及凋亡的影響及其機制。方法采用MTT法測定細胞活力、流式細胞術檢測細胞凋亡和線粒體跨膜電位的變化，Western blot法檢測PARP、cleaved?PARP、AKT及p?AKT蛋白的表達。結果MTT結果顯示：Bufalin以時間及劑量依賴的方式抑制MCF?7細胞增殖，24、48和72 h的IC50分別為317、50和32 nmol/L。流式分析結果顯示：Bufalin可誘導MCF?7細胞發生G2/M期阻滯及凋亡。進一步研究發現Bufalin作用后會導致線粒體跨膜電位下調，從而導致線粒體內凋亡通路的活化。Western blot結果顯示：Bufalin作用后會導致AKT的一過性活化，最終AKT的活性被滅活，PARP裂解，細胞發生凋亡。結論Bufalin可通過下調AKT的活性誘導乳腺癌MCF?7細胞凋亡。

蟾毒靈；AKT；乳腺癌；凋亡

乳腺癌是嚴重危害女性健康的惡性腫瘤之一，近年來發病呈上升趨勢［1］。隨著科技的發展，乳腺癌治療水平已顯著提高，但每年仍有40余萬女性死于乳腺癌［2］。研究顯示，大部分發生遠處轉移的患者對前期用藥產生耐藥，因此急需探索新的藥物以提高乳腺癌的療效。應用中藥及其有效成分進行的綜合治療是近年來腫瘤領域的研究熱點，可能為乳腺癌的治療開辟新的途徑。

蟾毒靈（Bufalin）是中藥蟾酥的活性成分之一，既往研究發現Bufalin可抑制血液系統腫瘤、胃癌和肝癌細胞的增殖［3］。本研究擬探討Bufalin對乳腺癌MCF?7細胞增殖和凋亡的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細胞株MCF?7購自中國科學院上海細胞庫。Bufalin、MTT、碘化丙錠（propidium io?dide，PI）均購自Sigma Aldrich公司（St.Louis，美國），一抗兔抗人anti?PARP、anti?actin、anti?AKT和anti?p?AKT購自Santa Cruze公司，二抗HRP標記的羊抗兔及羊抗鼠IgG均購自Santa Cruze公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：用含10%小牛血清的1640完全培養基，在37℃、5%CO2、100%濕度的培養箱中培養MCF?7細胞。待細胞剛剛長滿培養瓶底部時，以0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化成單個細胞，繼續傳代，并取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 藥物處理及分組：Bufalin用DMSO配制成終末濃度為1×10-2mol/L的無菌液-20℃保存，實驗時根據需要再配制成不同濃度。將細胞隨機分為藥物溶劑對照組、單純細胞對照組和實驗組。

1.2.3 MTT法檢測細胞活力：取對數生長期細胞，調整細胞濃度為3.5×104/mL，接種于96孔培養板內，每孔180 μL。24 h后加藥，實驗組加Bufalin，終濃度分別為0、5、10、20、40、80、160 nmol/L，單純細胞對照組不加任何處理因素，藥物溶劑對照組加等體積1640培養液。每組設3個平行孔，培養24、48、72 h后各孔加入20 μL MTT（5 g/L），孵育4 h后棄上清，加100 μL DMSO混勻震蕩15 min后，用酶聯免疫測定儀于570 nm波長條件下測定各孔的吸光度值（optical density，OD）。計算3孔平均值，按公式計算細胞增殖率，畫出細胞生存曲線，求出IC50。以上實驗重復3次。細胞生長的增殖率=（OD均值實驗組-OD均值藥物溶劑對照組）/（OD均值單純細胞對照組-OD均值藥物溶劑對照組）×100%。

1.2.4 流式細胞儀分析法檢測細胞凋亡及周期：將乳腺癌MCF?7細胞接種于6孔板內，實驗組加入50 nmol/L Bufalin，對照組加入等量Bufalin的溶劑，作用一定時間后分別收集對照組及實驗組細胞，70%乙醇固定過夜，加入20 μg/mL RNase A，37℃孵育30 min，再加入20 μg/mL PI避光孵育15 min，用FAC Scan流式細胞儀進行細胞凋亡的檢測及細胞周期分析。

1.2.5 線粒體跨膜電位（△ψm）檢測：取對數生長期的細胞，常規胰酶消化制成單細胞懸液，6孔板接種細胞（3×105/孔），培養12 h后實驗組加入50 nmol/L的Bufalin，對照組加入等量的培養液，24及48 h后分別收集對照組及實驗組的細胞，冷PBS洗2次，加入20 nmol/L DiOC6于37℃避光孵育15 min，流式細胞儀檢測DiOC6熒光強度。采用CELLQuest軟件進行分析。

1.2.6 Western blot法檢測PARP、β?actin、AKT、p?AKT蛋白的表達水平及活性：用4℃PBS洗滌MCF?7細胞，Bufalin作用0、3、6、12、24 h后，加入100 μL含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中，超聲粉碎，4℃裂解40 min，4℃15 000 r/min離心30 min，取上清，以上步驟均于冰上操作。采用Lowry法進行總蛋白定量，以1∶2比例與3×樣品緩沖液混勻，煮沸5 min，行10%SDS聚丙烯凝膠電泳2 h，通過濕式轉印恒流60 mA、120 min，轉印到硝酸纖維素膜上，50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，按Marker標記的分子量剪裁轉印膜，一抗4℃過夜，二抗室溫孵育30 min。顯色，圖像采集及分析處理。

所有實驗均重復3次。采用GraphPad Prism version 5.00軟件計算Bufalin的IC50值。

2 結果

2.1 Bufalin對乳腺癌MCF?7細胞增殖的抑制作用和細胞周期的影響

MTT結果顯示：Bufalin以時間及劑量依賴的方式抑制細胞增殖，24、48和72 h的IC50分別為317、50和32 nmol/L（圖1A）。為明確Bufalin抑制MCF?7細胞增殖的機制，本研究進行了流式細胞儀分析檢測，結果顯示：24 h后，低濃度Bufalin主要誘導細胞發生G2/M期阻滯，而在高濃度Bufalin作用下大部分細胞發生凋亡（圖1B）。

圖1 Bufalin對乳腺癌MCF?7細胞增殖和細胞周期的影響Fig.1 Effects of bufalin on the proferation and cell cycle phase distribution of MCF?7 cells

2.2 Bufalin對MCF?7細胞形態和線粒體跨膜電位的影響

為檢測Bufalin對MCF?7細胞形態學的影響，本研究選擇了50 nmol/L（48 h IC50）的Bufalin進行進一步的實驗，實驗組加入50 nmol/L的Bufalin，對照組加入等量Bufalin的溶劑，在作用24 h后，蘇木素—伊紅染色，光學顯微鏡下觀察細胞形態學變化。結果顯示：與對照組相比，Bufalin作用24 h后部分細胞出現多核，核碎裂及凋亡小體，提示細胞發生了G2/M期阻滯和凋亡。Bufalin作用48 h后出現核碎裂及核小體的細胞明顯增多，多核細胞比例減少，提示凋亡細胞比例升高，G2/M期阻滯細胞比例減少，與流式細胞儀檢測結果一致。見圖2。

為明確Bufalin誘導MCF?7細胞凋亡的機制，50 nmol/L的Bufalin處理細胞24、48 h后經DiOC6染色，流式細胞術檢測線粒體跨膜電位變化，結果顯示：50 nmol/L的Bufalin作用24 h后線粒體跨膜電位下降30.7%，作用48 h后下降45.1%，提示Bufalin可能是通過下調線粒體跨膜電位，活化線粒體凋亡通路，誘導MCF?7細胞凋亡。見圖2。

圖2 Bufalin對MCF?細胞形態及線粒體跨膜電位的影響Fig.2 Effects of bufalin on cell morphology and mitochondrial transmembrane potential

2.3 Bufalin對AKT活性及凋亡底物蛋白PARP裂解的影響

為進一步研究Bufalin誘導乳腺癌MCF?7凋亡的機制，本研究檢測了凋亡底物蛋白PARP的裂解情況及細胞內主要的增殖存活信號AKT活性的變化，Western blot結果顯示：Bufalin作用3 h、6 h后，AKT活性明顯升高，但在作用24 h后AKT活性下降至本底水平（對照組，即0 h組）以下，PARP裂解明顯增強（圖3）。提示Bufalin可能是通過抑制增殖存活信號AKT的活性，啟動線粒體內凋亡通路，誘導乳腺癌MCF?7細胞凋亡。

圖3 Bufalin（50 nmol/L）作用不同時間后PARP的裂解與AKT活性的變化情況Fig.3 MCF?7 cells were treated by 50 nmol/L bufalin for indicated times，and the expression of PARP and AKT was analysed by Western blot

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，我國乳腺癌的發病率正以每年3%的速率遞增，每年約有13萬人被診斷為乳腺癌。隨著中藥提純技術的發展，目前中醫中藥在乳腺癌的基礎研究與臨床治療方面均取得了一定的進展，在臨床上成為惡性腫瘤有效的輔助治療手段之一，彌補了現代醫學的不足。蟾酥是我國的傳統中藥，是蟾蜍表皮腺體的分泌物，Bufalin是蟾酥的主要成分之一。既往研究顯示，在實體瘤中，Bufalin可抑制子宮內膜癌、卵巢癌、胃癌、肝癌等細胞增殖［4］，本研究結果發現，Bufa?lin可以時間及劑量依賴方式抑制乳腺癌MCF?7細胞增殖，提示臨床上含Bufalin的中成藥可能對乳腺癌的治療有效。

Bufalin對細胞周期的影響在不同的細胞表現不同，Huang等［5］在膀胱癌T24細胞的研究中發現它能誘導細胞發生G0/G1期阻滯，Xie等［6］在結腸癌細胞研究中發現Bufalin可誘導細胞發生自噬性凋亡，Zhang等［7］在肝癌HepG2細胞的研究中發現，Bufalin可誘導細胞發生G2/M期阻滯和凋亡而發揮抗腫瘤作用。本研究發現Bufalin可誘導乳腺癌MCF?7細胞發生G2/M期阻滯和凋亡。

細胞發生周期阻滯和凋亡時會發生形態學變化，本研究結果顯示：Bufalin作用24 h后，部分細胞發生了G2/M期阻滯，表現為細胞出現雙核及停滯于分裂中期，同時部分細胞發生了凋亡，形態學可見典型的凋亡改變，表現為細胞膜完整，細胞質固縮，胞核固縮或碎裂，可見凋亡小體，Bufalin作用48 h后凋亡細胞比例明顯升高，出現凋亡小體細胞比例升高。這與流式細胞儀檢測結果一致，從形態學上驗證了Bufalin是通過誘導細胞發生G2/M期阻滯和凋亡，從而抑制細胞增殖的。

細胞凋亡的發生機制目前認為主要有2條信號通路介導，一條是通過活化Fas/FasL或TNF/TNFR，激活下游信號通路的死亡受體通路，另一條是通過線粒體的信號通路，即通過下調線粒體跨膜電位，促進線粒體釋放細胞色素C等信號分子，激活下游信號通路，介導細胞凋亡的發生［8］。Qi等［9］的研究發現Bufalin可通過活化Fas介導的死亡受體通路誘導肝癌細胞凋亡。本研究結果顯示，Bufalin作用24 h后會導致線粒體跨膜電位下降，作用48 h后線粒體跨膜電位進一步下降，提示Bufalin是通過活化線粒體信號通路誘導MCF?7細胞凋亡。

細胞是“存活”還是“死亡”取決于細胞內存活信號與死亡信號之間的動態平衡，PARP是細胞內重要的底物蛋白，其活化裂解是細胞發生凋亡的必需條件，PARP的裂解情況是細胞發生凋亡的標志物［10］。Huang等［11］在多發性骨髓瘤的研究中發現Bufalin為一種新型的PARP1抑制劑，可通過導致PARP裂解下調PARP表達水平，誘導細胞凋亡。本研究結果顯示：Bufalin作用24 h后，細胞內PARP裂解明顯增強，提示細胞發生了凋亡。AKT是細胞內主要的存活及增殖信號，AKT的活化與腫瘤細胞的無限增殖與耐藥密切相關，可通過影響下游凋亡相關蛋白的活化介導細胞的耐藥［12］。下調AKT的活性可抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡。AKT是腫瘤臨床治療的潛在靶點，在進展期腎細胞癌患者中AKT抑制劑Perifosine現已處于Ⅱ期臨床試驗階段［13］，但AKT信號在Bufalin誘導乳腺癌細胞凋亡過程中發揮的作用尚未見報道。本研究結果發現：在Bufalin作用短時間后，AKT的活性上調，提示AKT參與了細胞早期應激過程，但最終AKT被滅活，同時PARP發生裂解，線粒體跨膜電位下降，線粒體凋亡通路活化，細胞發生凋亡，提示AKT活性最終滅活可能是Bufalin誘導乳腺癌MCF?7細胞凋亡的“開關”。

總之，本研究結果發現：Bufalin能夠以時間及劑量依賴的方式抑制乳腺癌MCF?7細胞增殖，可誘導細胞發生G2/M期阻滯和凋亡，并可能通過下調AKT的活性，導致線粒體跨膜電位的下調，啟動線粒體凋亡通路，誘導細胞凋亡。

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（編輯王又冬）

Bufalin Induced Apoptosis of MCF?7 Breast Cancer Cells by Down?regulating the Activity of AKT

YAN Shun?chao1，LIU Yun?peng2，QU Xiu?juan2，JIAO Xin3，LI Kai1，LI Wu?sheng1，ZOU Hua?wei1
（1.Department of Oncology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110022，China；2.Department of Medical Oncology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.Department of Respiratory Medicine，Shenyang Chest Hospital，Shenyang 110044，China）

ObjectiveTo investigate the effects of bufalin on the proliferation and apoptosis of MCF?7 cells，and explore the possible mechanism.MethodsCells proliferation was measured using MTT assay.Cells apoptosis and mitochondrial transmembrane potential were determined by flow cytometry.Expression of PARP，cleaved?PARP，AKT and p?AKT was analyzed by Western blot.ResultsBufalin could surppress the proferation of MCF?7 cells in a time and dose?dependent manner.The 24 h，48 h and 72 h IC50were 317 nmol/L，50 nmol/L and 32 nmol/L，respectively.Flow cytometry analysis showed that bufalin could induce G2/M cycle arrest and apoptosis of MCF?7 cells.Further analysis showed that bufalin treatment significantly down?regulated mitochondrial transmembrane potential.Western blot analysis demonstrated that bufalin treatment lead to a transiently activated of AKT signaling pathway and then completely inactivated it.Meanwhile，PARP was activated and cleaved.ConclusionBufalin induces apoptosisin MCF?7 cells through down?regulation of AKT activity.

Bufalin；AKT；breast cancer；apoptosis

R730.52

A

0258-4646（2014）07-0598-04

國家自然科學基金（81302313）

閆順朝（1984-），男，主治醫師，博士.

鄒華偉，E-mail：zouhw@sj-hospital.org

2014-03-12

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