全反式維甲酸對牙周炎小鼠輔助性T17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)的影響

王琳源，關(guān)寧，林曉萍，孫曉菊

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院牙周科，遼寧錦州121000；2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院腦與脊髓損傷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧錦州121001；3.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院口腔科，沈陽110004，4.遼寧省人民醫(yī)院口腔科，沈陽110016）

全反式維甲酸對牙周炎小鼠輔助性T17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)的影響

王琳源1，3，關(guān)寧2，林曉萍3，孫曉菊4

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院牙周科，遼寧錦州121000；2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院腦與脊髓損傷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧錦州121001；3.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院口腔科，沈陽110004，4.遼寧省人民醫(yī)院口腔科，沈陽110016）

目的探討全反式維甲酸（ATRA）對體外培養(yǎng)的牙周炎小鼠頸淋巴結(jié)細(xì)胞中輔助性T（Th）17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響及相關(guān)機(jī)制。方法分離牙齦卟啉單胞菌（P.gingivalis）誘導(dǎo)的牙周炎小鼠頸淋巴結(jié)細(xì)胞并在體外進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)分4組：空白對照組、2×10-5mol/L ATRA處理組、2×10-5mol/L ATRA+2×10-5mol/L維甲酸受體（RAR）α拮抗劑LE135處理組、2×10-5mol/L二甲基亞砜（DMSO）組，培養(yǎng)72 h。流式細(xì)胞儀檢測CD4+叉頭翼螺旋轉(zhuǎn)錄分子（Foxp3）+和CD4+維甲酸相關(guān)核孤兒受體（ROR）γτ+細(xì)胞。采用ELISA法檢測細(xì)胞上清中白細(xì)胞介素（IL）?17A、IL?10、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）?β1的表達(dá)。結(jié)果與DMSO組相比，ATRA處理組CD4+RORγτ+（Th17）細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的比例和數(shù)量明顯降低（P＜0.001），IL?17A的表達(dá)降低（P＜0.01），而CD4+Foxp3+（Treg）細(xì)胞的比例和數(shù)量顯著增加（P＜0.05），IL?10和TGF?β1表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。CD4+Foxp3+（Treg）和CD4+RORγτ+（Th17）細(xì)胞的比例和數(shù)量、細(xì)胞因子IL?17A、IL?10和TGF?β1表達(dá)水平在空白對照組、ATRA+LE135處理組及DMSO組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)論ATRA通過活化RARα，減少牙周炎小鼠Th17細(xì)胞并下調(diào)其相關(guān)細(xì)胞因子IL?17A，增加Treg細(xì)胞并上調(diào)其相關(guān)細(xì)胞因子IL?10和TGF?β1。

全反式維甲酸；牙周炎；輔助性T17細(xì)胞；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

牙周炎是由牙周菌斑微生物引發(fā)的炎性破壞性疾病，它不僅是導(dǎo)致成年人牙齒缺失的主要原因，而且也是其他系統(tǒng)性疾病如糖尿病、心血管病等的誘發(fā)因素，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量和全身健康。近年來越來越多的研究表明宿主對牙周菌斑微生物的免疫應(yīng)答是導(dǎo)致牙周組織損傷和牙周炎進(jìn)展的主要原因［1，2］，其中具有炎性效應(yīng)的輔助性T（T helper，Th）17細(xì)胞和具有免疫抑制作用的調(diào)節(jié)性T（regulatory T，Treg）細(xì)胞在牙周炎中發(fā)揮重要的作用［3～5］。我們前期動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明，在牙周炎中存在Th17/Treg免疫失衡狀態(tài)，全反式維甲酸（all?trans retinoic acid，ATRA）可通過調(diào)控Th17/Treg免疫失衡抑制牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gin?givalis，P.gingivalis）誘導(dǎo)的牙周炎［6］。然而ATRA調(diào)控牙周炎中Th17/Treg免疫失衡的作用機(jī)制尚不清楚。本研究中，我們在體外針對ATRA調(diào)控Th17/ Treg細(xì)胞的機(jī)制進(jìn)行深入的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器：腦心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基（BHI，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；氯化血紅素、羧甲基纖維素、ATRA、LE135、2?巰基乙醇、HEPES（美國Sigma公司）；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Invitrogen公司）；青霉素-鏈霉素（美國Hyclone公司）；FITC標(biāo)記的CD4、PE標(biāo)記的維甲酸相關(guān)核孤兒受體（retinoid?related orphan receptor，ROR）γτ、PE標(biāo)記的核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor?κ B ligand，RANKL）、Alexa 647標(biāo)記的叉頭翼螺旋轉(zhuǎn)錄分子（forkhead box P3，F(xiàn)oxp3）抗小鼠的單克隆抗體及相應(yīng)的同種型對照、流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；白細(xì)胞介素（interleukin，IL）?17A、IL?10和轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）?β1 ELISA試劑盒（武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司）；倒置顯微鏡（日本OLYMPUS）；酶標(biāo)儀（美國BIORAD公司）

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株的培養(yǎng)：

1.1.2.1P.gingivalisW83的培養(yǎng)及測定P.gingiva?lisW83由中國醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院潘亞萍教授惠贈(zèng)。脫脂牛奶保存的P.gingivalisW83菌株接種于BHI血瓊脂培養(yǎng)基（含維生素K 10 μg/mL，氯化血紅素0.25%，滅菌羊血5%）上，于37℃含體積分?jǐn)?shù)分別為80%N2、10%H2、10%CO2的厭氧環(huán)境下培養(yǎng)5 d。取菌環(huán)挑取黑色菌落分散于BHI液體培養(yǎng)液（含維生素K 10 μg/mL，氯化血紅素0.25%）中，增菌24 h。紫外分光光度計(jì)在波長600 nm下測細(xì)菌密度。細(xì)菌密度（/mL）=測得值×稀釋倍數(shù)×109，調(diào)整菌濃度至1×1010/mL備用。

1.1.2.2P.gingivalisW83抗原制備收集培養(yǎng)的P. gingivalisW83，于4℃、1 840 g離心15 min，PBS液清洗2次，用含0.8%甲醛的PBS液滅活（4℃24 h），PBS液清洗4次，調(diào)整濃度至1×109/mL備用。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級7周齡C57BL/6雌性小鼠3只，購于中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，牙列完整，無齲病及牙周疾病，體質(zhì)量約20 g，無特殊致病菌的環(huán)境中給予無菌飼料分籠喂養(yǎng)1周后按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可管理辦法》規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 牙周炎動(dòng)物模型的建立：收集培養(yǎng)的P.gingi?valisW83，于4℃、1 840 g離心15 min，無菌PBS液清洗2次。以菌密度1×1010/mL重懸于含2%羧甲基纖維素的PBS液中。用微量移液器將100 μL菌懸液涂抹于小鼠齦緣乃至整個(gè)口腔，連續(xù)涂抹7 d。于口腔感染結(jié)束后的第4周以吸入CO2的方法處死。建模標(biāo)準(zhǔn)：（1）牙槽骨吸收評價(jià)：從釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂?shù)木嚯x增大；（2）HE染色：牙周組織中炎性細(xì)胞浸潤增多、結(jié)締組織附著喪失并出現(xiàn)牙槽骨吸收。

1.2.2 取材：常規(guī)無菌取出牙周炎小鼠頸部淋巴結(jié)，將其放在200目的不銹鋼篩網(wǎng)上研磨，用含1%胎牛血清的PBS液反復(fù)沖洗，30 μm尼龍網(wǎng)過濾去除成團(tuán)的細(xì)胞，紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，PBS液清洗2次，棄上清，加入適量的含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗、50 mmol/L 2?巰基乙醇和10 mmol/L HEPES的RPMI1640培養(yǎng)液。計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL備用。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)：將牙周炎小鼠頸部淋巴結(jié)細(xì)胞懸液以細(xì)胞數(shù)2×105/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每只小鼠接種4孔。甲醛滅活的P.gingivalisW83抗原以4×106/孔加入培養(yǎng)孔。實(shí)驗(yàn)分組：空白對照組、2×10-5mol/L ATRA處理組、2×10-5mol/L ATRA+2×10-5mol/ L LE135處理組和2×10-5mol/L DMSO組，分別加入PBS 6 mL、7×10-4mol/L ATRA 6 mL、1.4×10-3mol/L ATRA 3 mL+1.4×10-3mol/L LE135 3 mL和7×10-4mol/L DMSO 6 mL至各組培養(yǎng)孔。藥物作用72 h，4℃、760g離心10 min，細(xì)胞上清部分用于ELISA檢測細(xì)胞因子IL?17A、IL?10和TGF?β1的表達(dá)。細(xì)胞部分用于流式檢測分析CD4+T、CD4+RORγτ+（Th17）、CD4+Foxp3+（Treg）和RANKL+CD4+細(xì)胞。

1.2.4 流式分析：將頸淋巴細(xì)胞懸液分別以細(xì)胞數(shù)5×105/管加入流式管并根據(jù)組別進(jìn)行編號。用FITC標(biāo)記的CD4抗體和PE標(biāo)記的RANKL抗體以及相應(yīng)的同型對照抗體進(jìn)行胞外因子染色，用Alexa 647標(biāo)記的Foxp3和PE標(biāo)記的RORγτ以及相應(yīng)的同型對照抗體進(jìn)行胞內(nèi)因子染色，PBS液含1%胎牛血清洗滌重懸，上流式細(xì)胞儀檢測。以前向散射角和側(cè)向散射角確定淋巴細(xì)胞群，應(yīng)用FlowJo 7.6.1軟件分析CD4+T、CD4+RORγτ+（Th17）、CD4+Foxp3+（Treg）和RANKL+CD4+細(xì)胞。

1.2.5 ELISA檢測：按照IL?17A、IL?10和TGF?β1 ELISA試劑盒說明進(jìn)行操作，在波長450 nm下測定光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞上清液中IL?17A、IL?10和TGF?β1的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用采用SPSS 11.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀分析

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果（圖1）顯示，與空白對照組相比，ATRA+LE135處理組和DMSO組CD4+T細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中的細(xì)胞比例無明顯變化（圖1A、1B，P＞0.05），而ATRA處理組CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞比例明顯降低（圖1A、1B，P＜0.05），并且ATRA組CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞比例明顯低于ATRA+LE135處理組和DMSO組（圖1 A、1B，P＜0.05）。

空白對照組、ATRA+LE135處理組和DMSO組3組中CD4+RORγτ+（Th17）和CD4+Foxp3+（Treg）細(xì)胞（圖1C～1E）及RANKL+CD4+細(xì)胞（圖1F、1G）在CD4+T細(xì)胞中的比例和數(shù)量上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；而ATRA處理組CD4+RORγτ+（Th17）細(xì)胞（圖1C～1E，P＜0.001）及RANKL+CD4+細(xì)胞（圖1F、1G，P＜0.01）的比例和數(shù)量明顯低于空白對照組、ATRA+LE135處理組和DMSO組，CD4+Foxp3+（Treg）細(xì)胞的比例和數(shù)量明顯高于上述3組（圖1C～1E，P＜0.05）。

2.2 ELISA檢測

ELISA結(jié)果顯示，空白對照組、ATRA+LE135處理組和DMSO組間Th17細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子IL?17A（圖2A，P＞0.05）和Treg細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子IL?10（圖2B，P＞0.05）和TGF?β1（圖2C，P＞0.05）蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與空白對照組、ATRA+LE135處理組和DMSO組相比，ATRA處理組IL?17A的蛋白表達(dá)顯著降低（圖2A，P＜0.01），而IL?10（圖2B，P＜0.001）和TGF?β1（圖2C，P＜0.05）蛋白表達(dá)明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

牙周炎是口腔臨床的常見病和多發(fā)病。目前臨床上治療牙周炎多依賴于機(jī)械性的去除牙菌斑，如潔治、刮治、牙周手術(shù)等，忽略了免疫細(xì)胞在牙周炎中的關(guān)鍵性作用［7］，新的治療方法應(yīng)著手于免疫細(xì)胞為核心的免疫調(diào)節(jié)治療。前期的動(dòng)物體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)ATRA能夠調(diào)控牙周炎中Th17/Treg免疫失衡狀態(tài)，進(jìn)而對P.gingivalis誘導(dǎo)的牙周炎發(fā)揮保護(hù)性作用［6］。與前期研究結(jié)果相一致，本研究中我們發(fā)現(xiàn)ATRA在體外能夠?qū)ρ乐苎仔∈蟮腡h17和Treg細(xì)胞發(fā)揮調(diào)控作用，并且ATRA的這種調(diào)控作用可被維甲酸受體（retinoic acid receptor，RAR）α拮抗劑LE135阻斷。

Th17細(xì)胞作為一類效應(yīng)性的CD4+T細(xì)胞亞群，特征性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子RORγτ和RORα，通過分泌IL?17A/F、IL?22、IL?21等炎性相關(guān)細(xì)胞因子參與機(jī)體防御胞外菌感染、抗寄生蟲免疫。此外，Th17細(xì)胞被認(rèn)為是一類關(guān)鍵的CD4+T細(xì)胞亞類參與自身免疫性疾病和炎性疾病［8］。研究發(fā)現(xiàn)在慢性牙周炎患者的病變牙齦組織中Th17細(xì)胞浸潤增多，并與牙周組織損傷正相關(guān)［3］，表明Th17細(xì)胞參與牙周炎的炎性反應(yīng)和組織損傷。與之相反，Treg細(xì)胞是體內(nèi)天然存在的具有獨(dú)特調(diào)節(jié)功能的CD4+T細(xì)胞亞群，特異性地表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，通過細(xì)胞間直接接觸或分泌細(xì)胞因子（IL?10、TGF?β）等方式，抑制體內(nèi)多種免疫細(xì)胞的活化和增殖，削弱炎性效應(yīng)，維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定［9，10］。有研究發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞可通過膜表面分子如糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)腫瘤壞死因子受體和分泌的抑炎性細(xì)胞因子如IL?10和TGF?β緩解牙周炎［5］，表明Treg細(xì)胞參與牙周炎發(fā)病過程中維持組織穩(wěn)態(tài)和組織損傷的修復(fù)。動(dòng)物體內(nèi)研究表明在牙周炎中存在Th17/Treg免疫失衡狀態(tài)，出現(xiàn)Th17細(xì)胞增多而Treg細(xì)胞比例降低。全反式維甲酸可以有效降低Th17細(xì)胞，同時(shí)增加Treg細(xì)胞，參與對P. gingivalis誘導(dǎo)牙周炎的保護(hù)作用［6］。在本研究中，我們通過體外細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)體系發(fā)現(xiàn)，全反式維甲酸能夠減少Th17細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的比例和細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)增加Treg細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的比例和細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)一步證明全反式維甲酸能有效調(diào)控牙周炎中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞在細(xì)胞比例和細(xì)胞數(shù)量上的失衡狀態(tài)。

圖1 流式細(xì)胞儀分析CD4+、CD4+Foxp3+（Treg）、CD4+RORγτ+（Th17）和RANKL+CD4+細(xì)胞的表達(dá)情況Fig.1 Flow cytometry analysis of CD4+，CD4+Foxp3+（Treg），CD4+RORγτ+（Th17）and RANKL+CD4+cells

圖2 ELISA法檢測細(xì)胞上清中Th17細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子IL?17A和Treg細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子IL?10和TGF?β1蛋白表達(dá)Fig.2 Protein expressions of Th17 cell?related cytokine IL?17A and Treg cell?related cytokines IL?10 and TGF?β1 by ELISA

以往動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，在牙周炎的病損組織中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)增高［3，5］，與他們的研究結(jié)果相一致，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在牙周炎的病損牙周組織中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)均增高，但上調(diào)的Treg細(xì)胞相關(guān)的抑炎性細(xì)胞因子IL?10和TGF?β1不能有效對抗上調(diào)的Th17細(xì)胞相關(guān)的促炎性細(xì)胞因子IL?17A，不能抑制牙周炎。并且全反式維甲酸可以調(diào)節(jié)牙周炎中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子效應(yīng)間的不平衡狀態(tài)，進(jìn)而參與抑制P.gingivalis誘導(dǎo)牙周炎［6］。在本研究中，全反式維甲酸能夠有效降低Th17細(xì)胞相關(guān)的促炎性細(xì)胞因子IL?17A的表達(dá)，同時(shí)增加Treg細(xì)胞相關(guān)的抑炎性細(xì)胞因子IL?10和TGF?β1的表達(dá)，進(jìn)一步證明全反式維甲酸可有效調(diào)控牙周炎中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子效應(yīng)間的不平衡狀態(tài)。

牙槽骨吸收是牙周炎最具特征性的表現(xiàn)。RANKL是近年來發(fā)現(xiàn)的與骨吸收密切相關(guān)的細(xì)胞因子［11］。研究發(fā)現(xiàn)牙周炎病損組織處牙周致病菌特異性的CD4+T細(xì)胞表面表達(dá)骨吸收因子RANKL，與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞或破骨細(xì)胞表面的RANK結(jié)合，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化、成熟和骨吸收功能的發(fā)揮。采用抗RANKL抗體可有效抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的牙槽骨吸收，提示T細(xì)胞介導(dǎo)的牙槽骨吸收主要是RANKL依賴性的［12］。研究發(fā)現(xiàn)在慢性牙周炎患者的病損牙周組織中，Th17細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子IL?17和轉(zhuǎn)錄因子RORC與RANKL的表達(dá)呈正相關(guān)，而Treg細(xì)胞能夠負(fù)調(diào)控RANKL的表達(dá)［13，14］。我們前期研究表明全反式維甲酸可通過減少RANKL+CD4+細(xì)胞參與抑制P.gingivalis誘導(dǎo)的牙周炎［6］。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在體外全反式維甲酸可有效降低RANKL+CD4+細(xì)胞在總CD4+T細(xì)胞中的比例和數(shù)量，進(jìn)一步證實(shí)全反式維甲酸對牙周炎中RANKL+CD4+細(xì)胞的抑制作用。

研究表明ATRA主要通過RARα在免疫介導(dǎo)的炎性反應(yīng)中發(fā)揮抑制和保護(hù)性作用［15］。在本研究中，我們采用RARα拮抗劑LE135阻斷全反式維甲酸與RARα的結(jié)合，研究發(fā)現(xiàn)在加入LE135后，全反式維甲酸對Th17/Treg免疫失衡的調(diào)控作用及對RANKL+CD4+細(xì)胞的抑制作用消失，表明LE135能有效阻斷全反式維甲酸調(diào)控Th17/Treg免疫失衡的作用，提示全反式維甲酸通過活化RARα，調(diào)控Th17/Treg免疫失衡，進(jìn)而對P.gingivalis誘導(dǎo)的牙周炎發(fā)揮保護(hù)性作用。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明全反式維甲酸通過活化RARα調(diào)控牙周炎中Th17/Treg免疫失衡，進(jìn)一步證實(shí)了全反式維甲酸對Th17/Treg免疫失衡的調(diào)控作用并初步探討了相關(guān)的作用機(jī)制，為以免疫細(xì)胞為核心通過免疫調(diào)控治療牙周炎提供一種新的臨床方案，也為Th17/Treg免疫失衡相關(guān)疾病提供新的防治策略。

［1］Hernández M，Dutzan N，García?Sesnich J，et al.Host?pathogen in?teractions in progressive chronic periodontitis［J］.J Dent Res，2011，90（10）：1164-1170.

［2］Gemmell E，Yamazaki K，Seymour GJ.The role of T cells in peri?odontal disease：homeostasis and autoimmunity［J］.Periodontol 2000，2007，43：14-40.

［3］Cardoso CR，Garlet GP，Crippa GE，et al.Evidence of the presence of T helper type 17 cells in chronic lesions of human periodontal dis?ease［J］.Oral Microbiol Immunol，2009，24（1）：1-6.

［4］Eskan MA，Jotwani R，Abe T，et al.The leukocyte integrin antago?nist Del?1 inhibits IL?17?mediated inflammatory bone loss［J］.Nat Immuno，2012，13（5）：465-473.

［5］Garlet GP，Cardoso CR，Mariano FS，et al.Regulatory T cells attenu?ate experimental periodontitis progression in mice［J］.J Clin Peri?odontol，2010，37（7）：591-600.

［6］Wang L，Wang J，Jin Y，et al.Oral administration of all?trans retino?ic acid suppresses experimental periodontitis by modulating the Th17/Treg imbalance［J］.J Periodontol，2014，85（5）：740-750.

［7］王琳源，林曉萍，靳贏.適應(yīng)性免疫應(yīng)答在牙周炎中的作用［J］.中華口腔醫(yī)學(xué)，2013，48（2）：115-118.

［8］Peters A，Lee Y，Kuchroo VK.The many faces of Th17 cells［J］. Curr Opin Immunol，2011，23（6）：702-706.

［9］Bin Dhuban K，Kornete M，S Mason E，et al.Functional dynamics of Foxp3（+）regulatory T cells in mice and humans［J］.Immunol Rev，2014，259（1）：140-158.

［10］程仕彤，馮鷺，劉麗娜，等.α?干擾素對肝纖維化小鼠肝組織中Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，42（5）：402-405.

［11］Boyce BF，Xing L.Functions of RANKL/RANK/OPG in bone mod?eling and remodeling［J］.Arch Biochem Biophys，2008，473（2）：139-146.

［12］Lin X，Han X，Kawai T，et al.Antibody to receptor activator of NF?κB ligand ameliorates T cell?mediated periodontal bone resorption［J］.Infect Immun，2011，79（2）：911-917.

［13］Dutzan N，Gamonal J，Silva A，et al.Over?expression of forkhead box P3 and its association with receptor activator of nuclear factor?kappa B ligand，interleukin（IL）?17，IL?10 and transforming growth factor?beta during the progression of chronic periodontitis［J］.J Clin Periodontol，2009，36（5）：396-403.

［14］Ernst CW，Lee JE，Nakanishi T，et al.Diminished forkhead box P3/ CD25 double?positive T regulatory cells are associated with the in?creased nuclear factor?kappaB ligand（RANKL+）T cells in bone resorption lesion of periodontal disease［J］.Clin Exp Immunol，2007，148（2）：271-280.

［15］Pino?Lagos K，Benson MJ，Noelle RJ.Retinoic acid in the immune system［J］.Ann N Y Acad Sci，2008，1143：170-187.

（編輯 陳姜）

Effects of All?trans Retinoic Acid on T Helper 17，Regulatory T Cells and Expression of Cell?related Cytokines in Periodontitis Mice in vitro

WANG Lin?yuan1，3，GUAN Ning2，LIN Xiao?ping3，SUN Xiao?ju4
（1.Department of Periodontics，The Second Affiliated Hospital of Liaoning Medical College，Jinzhou 121000，China；2.The Key Laboratory of Brain and Spinal Cord Injury Research，The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College，Jinzhou 121001，China；3.Department of Stomatology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；4.Department of Stomatology，People′s Hospital of Liaoning Province，Shenyang 110016，China）

ObjectiveTo investigate the effects and relative mechanism of all?trans retinoic acid（ATRA）on T helper（Th）17，regulatory T（Treg）cells and expression of cell?related cytokines in the cervical lymph nodes of periodontitis mice.MethodsExperimental periodontitis was in?duced in mice by oral infection ofPorphyromonas gingivalis.The cervical lymph nodes of periodontitis mice were isolated and cultured in vitro.The cells were randomly divided into four groups，including the control group，2×10-5mol/L ATRA treatment group，2×10-5mol/L ATRA+2×10-5mol/L retinoid acid receptor（RAR）α antagonist LE135 treatment group and 2×10-5mol/L dimethyl sulfoxide（DMSO）.CD4+，CD4+retinoid?related or?phan receptor γτ（RORγτ）+（Th17），CD4+forkhead box P3（Foxp3）+（Treg）and receptor activator of nuclear factor?κB ligand（RANKL）+CD4+cells were analyzed by flow cytometry 72 hours after the incubation.Th17 cell?related cytokine interleukin（IL）?17A，Treg cell?related cytokines IL?10 and transforming growth factor（TGF）?β1 expression were detected in the cell supernatants by enzyme?linked immunosorbent assays（ELISA）.ResultsCompared to DMSO group，the percentage of CD4+T and cell number of Th17 cells were reduced（P＜0.001），whereas Treg cells were in?creased in ATRA?treated group（P＜0.05）.Moreover，the expression of Th17 cell?related cytokine IL?17A was down?regulated（P＜0.01），where?as that of Treg cell?related cytokines IL?10 and TGF?β1 was up?regulated in ATRA?treated group（P＜0.05）.No significant differences were found in Th17 and Treg cells orcell?related cytokines among blank control group，ATRA+LE135?treated group and DMSO group（P＞0.05）.Conclu?sionATRA treatment reduced Th17 cells and down?regulated cell?related cytokine IL?17A，whereas increased Treg cells and up?regulated cell?re?lated cytokines IL?10 and TGF?β1 through activating RARα.

all?trans retinoic acid；periodontitis；T helper 17 cell；regulatory T cell

R781.4

A

0258-4646（2014）07-0606-06

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（20112104110013）；遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（2012225015）

王琳源（1980-），女，主治醫(yī)師，博士研究生.

林曉萍，E-mail：xiaoping_ba@126.com

2014-04-21

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：