ICU患者分離的耐亞胺培南鮑曼不動桿菌同源性及耐藥機制

羅湘蓉，李恒翠，袁軍，劉心梅，牟霞，胡方芳，黃盛文

（1.貴州省人民醫院中心實驗室，貴陽550002；2.遵義醫學院檢驗系2009級，貴州遵義563000；3.貴州省人民醫院檢驗科，貴陽550002；4.貴州省人民醫院院感科，貴陽550002）

ICU患者分離的耐亞胺培南鮑曼不動桿菌同源性及耐藥機制

羅湘蓉1，李恒翠2，袁軍1，劉心梅3，牟霞4，胡方芳1，黃盛文3

（1.貴州省人民醫院中心實驗室，貴陽550002；2.遵義醫學院檢驗系2009級，貴州遵義563000；3.貴州省人民醫院檢驗科，貴陽550002；4.貴州省人民醫院院感科，貴陽550002）

目的了解ICU患者分離的耐亞胺培南鮑曼不動桿菌（IRAB）的同源性和耐藥機制。方法收集臨床標本分離的35株IRAB，采用腸桿菌科基因組內重復序列聚合酶鏈反應（ERIC?PCR）進行基因同源性分析；采用EDTA協同實驗進行金屬β?內酰胺酶（MBLs）的表型檢測；采用多重PCR技術擴增IRAB的OXA?23、OXA?24、OXA?51、OXA?58基因及Imp、Vim、Sim基因。結果35株IRAB經ERIC?PCR基因分型，分為A、B型，其中31株為A型，4株為B型。所有菌株均攜帶有OXA?23和OXA?51基因。MBLs的表型及基因型檢測均為陰性。結論該院ICU流行的IRAB主要由克隆株傳播所致，耐藥機制主要為產生OXA?23基因。

重癥監護病房；亞胺培南；鮑曼不動桿菌；同源性；耐藥機制

鮑曼不動桿菌是醫院感染的重要病原菌，極易引起院內感染爆發流行。亞胺培南等碳青霉烯類抗生素通常作為治療重癥鮑曼不動桿菌感染的首選藥物，但由于該類抗生素的廣泛應用，對其耐藥的鮑曼不動桿菌不斷增加，給臨床治療和院內感染控制帶來極大困難。人們對其分子流行病學和耐藥機制尚不完全清楚。而且各個醫院由于用藥習慣不同、環境不同，耐亞胺培南鮑曼不動桿菌（imi?penem?resistantAcinetobacter baumannii，IRAB）的耐藥性、傳播的基因型、耐藥機制存在差異。本研究收集了2012年8至12月從貴州省人民醫院外科ICU、呼吸內科ICU、神經內科ICU分離的IRAB 35株，并分析其同源性、碳氫霉烯酶基因型的產生情況。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

2012年8至12月從貴州省人民醫院外科ICU、呼吸內科ICU、神經內科ICU的臨床標本中分離35株IRAB，其中31株來自痰標本，其余4株分別來自腦脊液、導管尖端、肺泡灌洗液、滲出液，均為非重復菌株。菌株的分離培養嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》進行，采用PHOENIX全自動微生物分析儀進行菌株鑒定、藥敏。質控菌株：大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853，購自衛生部臨床檢驗中心。OXA?23陽性鮑曼不動桿菌為本實驗室保存。

1.2 主要儀器及試劑

PHOENIX全自動微生物分析儀及其配套試劑購自美國BD公司；CapitalBio PCR儀購自杭州博日科技有限公司；DYY?6C型電泳儀購自北京市六一儀器廠；BOXEF凝膠電泳成像系統購自美國基因公司；水解酪蛋白瓊脂平板購自廣州迪景公司；亞胺培南藥敏紙片購自英國Oxoid公司；乙二胺四乙酸（EDTA）購自重慶化學試劑廠；PCR試劑、引物購自上海生工生物工程有限公司；PCR試劑盒、多重PCR試劑盒、Marker購自大連寶生物有限公司。

1.3 DNA的提取

煮沸法提取DNA，操作過程［1］如下：取過夜培養的菌落4～5個懸于250 μL蒸餾水，95℃水浴15 min，冰浴冷卻5 min后10 000 r/min離心10 min，取上清液放于滅菌的EP管中，-20℃保存待用。

1.4 同源性分析

采用腸桿菌科基因組內重復序列聚合酶鏈反應（enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR，ERIC?PCR），引物序列：5′?AAGTAAGTGACTG GGGTGAGCG?3′［1］。反應體系［2］：體積25 μL，引物1 μL；dNTP 1.75 μL；taq酶0.25 μL；DNA模板1 μL； 10×PCR buffer 2.5 μL；蒸餾水18.5 μL。PCR擴增程序：94℃預變性5 min，94℃變性1 min，42℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個循環后72℃延伸10 min。1.8%的瓊脂糖凝膠電泳1.5 h。凝膠成像系統下面觀察結果并拍照。結果判斷標準：不論條帶密度，只要條帶數目與位置相同則為同一型。

1.5 MBLs表型檢測

采用EDTA協同實驗，參照文獻［3］并作改良，挑取菌落配制0.5麥氏單位菌液，均勻涂布于MH平板上，放置10 min吸干水分，貼上亞胺培南藥敏紙片和空白紙片，2紙片之間相距1.2 cm，空白紙片上加10 μL的0.5 mol/L EDTA溶液；放置35℃孵育過夜觀察結果。若亞胺培南抑菌圈在靠近EDTA的一側增大，為EDTA協同實驗陽性，也就是該菌MBLs表型篩查陽性，否則為陰性。

1.6 多重PCR擴增OXA、MBLs基因［4，5］

采用多重PCR，PCR反應體系：體積50 μL，Multi?plex PCR Mix2 25 μL，Primer Mix（引物序列見表1）各加1 μL；Multiplex PCR Mix1 0.25 μL，DNA模板2 μL，滅菌蒸餾水補足50 μL；PCR反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性25 s，52℃退火40 s，72℃延伸50 s，35個循環后72℃延伸6 min。1.8%的瓊脂糖凝膠電泳42 min。使用凝膠成像系統觀察結果并拍照。

2 結果

2.1 同源性分析

35株IRAB分為2型，其中31株為A型，占88.6%；另外4株為B型，占11.4%。見圖1。

表1 OXA、MBLs基因引物序列Tab.1 Primer sequences of OXA and MBLs genes

圖1 部分ERIC?PCR擴增產物電泳圖Fig.1 Representative electropherogram of ERIC?PCR products

2.2 IRAB分型與科室分布

A型分布為外科ICU 14株，呼吸內科ICU 13株，神經內科ICU 4株；B型分布為外科ICU 1株，呼吸內科ICU 3株。

2.3 MBLs表型檢測

35株IRAB的MBLs表型檢測均為陰性。

2.4 多重PCR擴增結果

35株IRAB均檢測出OXA?23、OXA?51（圖2）；未檢測出OXA?24、OXA?58；未檢測出Imp、Vim和Sim基因。

圖2 部分OXA基因PCR擴增產物電泳圖Fig.2 Representative PCR electropherogram of OXA genes

3 討論

基因分型的方法比較多。本研究采用的ERIC?PCR，采用的引物是ERIC序列；ERIC序列是指革蘭陰性桿菌中存在的一段重復序列（約126 bp的片段），這段序列散在分布于基因中，遺傳穩定，在不同種屬間有拷貝數和位置變化。ERIC?PCR操作簡單、結果清晰、穩定，具備不要求模板序列已知而直接進行擴增的優點［1，2］。

耐藥菌株不斷增加，與克隆株在病房內及病房間的傳播有很大關系［1，2，6，8］。本研究采用ERIC?PCR對35株IRAB進行同源性分析，結果顯示：該院35株IRAB分為2型，其中A型（88.6%）為主要的流行型別，在外科ICU、呼吸內科ICU、神經內科ICU均有分布；B型（11.4%）為次要流行型別，分布在外科ICU、呼吸內科ICU。說明該院3個ICU病房在調查期內存在IRAB的克隆傳播。克隆株在科室間、科室內傳播很可能是IRAB增加的主要原因；造成克隆株播散的原因可能與沒有嚴格進行消毒隔離、無菌操作及患者的抵抗力低下等有關；因此加強控制感染的傳播至關重要。ICU的患者病情嚴重，免疫力低下，醫護人員更應該注意手衛生，重視醫療器械的消毒，盡量減少侵入性醫療操作次數，增強患者的抵抗力，及時發現并隔離感染患者。

鮑曼不動桿菌對碳氫霉烯類抗生素的耐藥機制主要是產生碳氫霉烯酶，碳氫霉烯酶能水解碳青霉烯類藥物，介導碳青霉烯類藥物耐藥。碳氫霉烯酶包括Ambler分類中的A、B、D 3類酶，在不動桿菌中發現的碳氫霉烯酶主要為B類和D類酶。D類為苯唑西林酶（OXA酶），B類為MBLs，屬于Bush分群的第3組。D類酶按照氨基酸的同源性可分為8組，在鮑曼不動桿菌中報道的主要是OXA?23、OXA?24、OXA?51和OXA?58這4組。本研究中35株IRAB，均檢出OXA?23和OXA?51。其中OXA?23是質粒介導的碳氫霉烯酶，檢出率100%，高于報道的72.5%［6］和92.7%［7］，與晏群等［8］報道的100%一致。OXA?51是染色體介導的鮑曼不動桿菌的固有基因，敏感和耐藥的鮑曼不動桿菌均攜帶該基因，OXA?51與碳氫霉烯類抗生素的結合能力、水解能力弱，但在抗生素選擇壓力下，該基因被過度表達可導致碳氫霉烯類抗生素的耐藥［9］。因此該院ICU中IRAB的主要耐藥機制為產生OXA?23基因，與文獻結果一致［6～8］，OXA?23基因合并其他耐藥機制的情況，如外膜通透性降低和外排系統，還有待進一步研究。

總之，在調查期間我院ICU存在IRAB的克隆播散，主要耐藥機制為產生OXA?23基因。

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（編輯 陳姜）

Study on the Homology and Resistance Mechanism of Iminepem?resistantAcinetobacter baumanniiIsolated from ICU Patients

LUO Xiang?rong1，LI Heng?cui2，YUAN Jun1，LIU Xin?mei3，MU Xia4，HU Fang?fang1，HUANG Sheng?wen3
（1.Central Laboratory，People′s Hospital of Guizhou Province，Guiyang 550002，China；2.Department of Laboratory 2009，Zunyi Medical College，Zunyi563000，Chi?na；3.Department of Laboratory，People′s Hospital of Guizhou Province，Guiyang 550002，China；4.Department of Hospital Infection，People′s Hospital of Guizhou Province，Guiyang 550002，China）

ObjectiveTo investigate the homology and resistance mechanism of iminepem?resistantAcinetobacter baumannii（IRAB）isolated from ICU patients.MethodsA total of 35 strains of IRAB from ICU clinical specimens were collected，and the homology of these strains was ana?lyzed by enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR（ERIC?PCR）.The metal beta?lactamase（MBLs）phenotype was detected by EDTA synergy test.Multiplex PCR was used to amplify carbapenemase genes，including four kinds ofOXAgenes（OXA?23，OXA?24，OXA?51，andOXA?58）and three kinds of MBLs genes（Imp，Vim，andSim）.ResultsTwo genomic types were detected in the 35 strains of IRAB by ERIC?PCR，in?cluding 31 strains of type A and 4 strains of type B.TheOXAgenes ofOXA?23andOXA?51was expressed in all these strains.MBLs phenotype and genotype of the test were negative.ConclusionThere was prevalence of the IRAB mainly caused by clones in the hospital ICU，and the resis?tance mechanism could be the expression ofOXA?23.

ICU；imipenem；Acinetobacter baumannii；homology；resistance mechanism

R378

A

0258-4646（2014）07-0612-03

貴州省衛生廳科學技術基金（gzwkj2012?1?106）；貴州省科技計劃課題（黔科合LS字［2012］030號）

羅湘蓉（1973-），女，副主任技師，碩士.

袁軍，E-mail：99430junyuan@163.com

2014-04-02

網絡出版時間：