動員大鼠自體骨髓干細(xì)胞修復(fù)損傷心肌

王勃，佟文姝，李雯娜，郭瀟繁

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.心血管內(nèi)科；2.心血管檢查科，沈陽110001）

動員大鼠自體骨髓干細(xì)胞修復(fù)損傷心肌

王勃1，佟文姝2，李雯娜1，郭瀟繁1

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.心血管內(nèi)科；2.心血管檢查科，沈陽110001）

目的探討應(yīng)用rhG?CSF促進(jìn)骨髓干細(xì)胞原位移植對損傷心肌的修復(fù)作用。方法采用異丙基腎上腺素腹腔注射建立大鼠急性心肌損傷模型；通過外源性細(xì)胞因子rhG?CSF動員骨髓干細(xì)胞增殖、釋放、遷移歸巢至損傷心肌局部；應(yīng)用HE染色結(jié)合圖像分析系統(tǒng)，對兩組心肌進(jìn)行對比性分析；應(yīng)用八導(dǎo)記錄儀檢測心臟功能。結(jié)果原位移植組的心肌損傷面積小于對照組；原位移植組心臟收縮功能較對照組明顯改善。結(jié)論腹腔注射異丙基腎上腺素可復(fù)制急性心肌損傷模型；應(yīng)用骨髓干細(xì)胞動員劑rhG?CSF，可促進(jìn)壞死心肌修復(fù)，提高心臟收縮功能。

骨髓干細(xì)胞；急性心肌損傷；rhG?CSF

人類的心臟雖然不是一終末分化器官，但是成體心臟干細(xì)胞的數(shù)量極少［1］，另外目前的藥物和介入治療雖然能有效地干預(yù)急性心肌損傷（acute myo?cardial injury，AMI）的發(fā)生和預(yù)后，但這些都不足以代償損傷的心肌，最終由纖維母細(xì)胞增生形成纖維瘢痕替代原心肌組織，導(dǎo)致心臟收縮功能減低。近年來自體細(xì)胞移植為心臟疾病的治療展示了一幅美好的前景，研究表明：再生能力較強的骨髓干細(xì)胞（bone marrow stem cells，BMSC）具有向其他組織橫向分化的能力，這對于缺乏干細(xì)胞的心臟組織再生非常重要。粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte col?ony stimulating factor，G?CSF）是一種糖蛋白，由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可作用于BMS，促進(jìn)其增值、分化［2～4］。本項研究中，我們啟用外源性細(xì)胞因子，觀察自體BMSC通過增殖、釋放、遷移、歸巢、轉(zhuǎn)分化，對損傷壞死心臟的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗儀器：日本日立7150型全自動生化分析儀、自動石蠟切片機（RM2155 Model，Germany）、光學(xué)顯微鏡（BX60 Model，OLYMPUS，Japan）、圖像采集系統(tǒng)（BX41 Model，OLYMPUS，Japan）、顯微圖像分析處理系統(tǒng)（MetaMorph/DP10/BX51 VS.VIC/JP Model，OLYMPUS，Japan）、八導(dǎo)生理記錄儀（RM?6000 Model，NIHON KOHDEN）。

1.1.2 實驗藥品與試劑：異丙基腎上腺素注射液（上海禾豐制藥廠生產(chǎn)）、rhG?CSF（長春金磊賽強生物制藥有限公司提供）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組：領(lǐng)取Wistar大鼠60只，雌、雄各半，體質(zhì)量（255±44.68）g。隨機分為原位移植組（si?tu transplantation group，STG）30只，對照組30只。

1.2.2 rhG?CSF干預(yù)：STG：rhG?CSF 50 μg/（kg·d）、皮下注射8 d。對照組：等量生理鹽水皮下注射8 d。

1.2.3 建立大鼠急性心肌損傷模型：參照文獻(xiàn)［5，6］，STG、對照組分別于rhG?CSF、生理鹽水干預(yù)第5天，以異丙基腎上腺素（10 mg/kg）腹腔注射。

1.2.4 檢測血清心肌酶學(xué)：于造模前、后48 h，穿刺尾靜脈，留取外周血，并于全自動生化分析儀檢測血清肌酸磷酸激酶（creatine phosphokinase，CPK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平。

1.2.5 制備大鼠心肌損傷標(biāo)本：于造模后48 h、1周，STG、對照組隨機各取2～3只大鼠處死、前胸剃毛、無菌消毒后取出心臟，于生理鹽水中沖洗，沿心臟長軸將其切為2部分。10%甲醛溶液中固定48 h，取出后依次放入濃度為60%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇中脫水?二甲苯透明40 min、58～60℃石蠟中浸蠟90 min制備蠟塊、切片、展片、烤片。行蘇木素-伊紅（HE）組織化學(xué)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.6 計算心肌損傷、壞死面積：將石蠟塊以每隔100 μm間距切取5 μm厚，每塊石蠟塊取4片，行HE染色后通過顯微圖像分析系統(tǒng)計算每張切片中心肌損傷、壞死區(qū)占整個心室肌總面積的百分比。

1.2.7 檢測各項心臟功能指標(biāo)：調(diào)整八導(dǎo)生理記錄儀各項參數(shù)。將造模后4周大鼠以苯巴比妥鈉（100 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉。固定四肢、剃毛、頭頸部消毒、依次切開皮膚及皮下組織，游離頸動脈，下方備用2根縫合線，近頭端扎緊，近心端待用，動脈夾阻斷血流，剪開動脈周長的1/3，插入充滿肝素的導(dǎo)管，待用線固定，連接多導(dǎo)儀換能器，擰開動脈夾。示波儀顯示動脈波形曲線，走紙記錄，將導(dǎo)管繼續(xù)送入左心室。示波儀顯示左心室壓力曲線，走紙記錄。處死大鼠后留取心臟，標(biāo)本制備過程同前。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果

2.1 心肌酶學(xué)變化

心臟壞死標(biāo)志物——心肌酶學(xué)變化兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見表1。

表1 比較兩組造模前、后心肌酶學(xué)變化Tab.1 Changes of myocardial enzyme between two groups before and after modeling

表1 比較兩組造模前、后心肌酶學(xué)變化Tab.1 Changes of myocardial enzyme between two groups before and after modeling

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2.2 形態(tài)學(xué)變化

顯微鏡下觀察：兩組于造模后48 h均可見：乳頭肌、心尖部、內(nèi)膜中層心肌纖維呈現(xiàn)網(wǎng)格狀改變，其內(nèi)分布大量核大深染、胞質(zhì)少的炎性細(xì)胞，為心肌壞死灶（圖1～3）。造模后1周：可見STG網(wǎng)格狀面積縮小，其內(nèi)可見限局性單個核細(xì)胞聚集灶，較前比較胞質(zhì)增多、胞核小、深染、似分化的心肌細(xì)胞。而對照組仍見散在的索條狀、網(wǎng)格狀壞死灶，浸潤的炎性細(xì)胞明顯減少（圖4）。

2.3 兩組心肌損傷面積的比較

應(yīng)用顯微圖像分析處理系統(tǒng)計算每張切片中損傷壞死心肌占心室肌總面積的百分比，采用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件分別比較造模后48 h、1周、4周的組間差異，見表2。

2.4 STG、對照組間心功能參數(shù)的比較

圖1 正常心肌組織HE染色×400Fig.1 Normal myocardial tissue in rat HE staining，×400

兩組于造模后4周采用八導(dǎo)生理記錄儀記錄頸動脈內(nèi)、左心室壓力曲線，進(jìn)而推算出各心功能參數(shù)，見表3。

圖2 STG AMI后48 h HE染色Fig.2 48 hours after AMI in STG HE staining

圖3 對照組AMI后48 h HE染色Fig.3 48 hours after AMI in control HE staining

圖4 AMI后1周HE染色Fig.4 1 week after AMI HE staining

表2 STG與對照組間心肌損傷面積的比較Tab.2 Comparison of myocardial necrosis area between STG and control group

3 討論

依據(jù)干細(xì)胞分化潛能可分為：全能干細(xì)胞、多潛能干細(xì)胞、成體干細(xì)胞。因其具有自我復(fù)制、可無限擴增及定向誘導(dǎo)分化等特點，近來已成為基礎(chǔ)及臨床研究熱點。Doetachman等［7］于1985年首次報道了小鼠胚胎干細(xì)胞向內(nèi)臟卵黃囊、血島及心肌細(xì)胞定向分化的現(xiàn)象，以后又陸續(xù)從豬、兔、及人類等胚胎干細(xì)胞分化出心肌細(xì)胞，為以后非心臟干細(xì)胞向心肌移植奠定了理論基礎(chǔ)。

成體干細(xì)胞為所在組織器官的前體細(xì)胞，具有轉(zhuǎn)分化或橫向分化的特點，即某種前體細(xì)胞經(jīng)損傷微環(huán)境的作用、細(xì)胞因子的誘導(dǎo)橫向分化為另外一種細(xì)胞，如骨髓干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞、骨骼肌成肌細(xì)胞等，這對于缺乏干細(xì)胞的成體心臟組織損傷壞死后的再生具有積極的治療意義。其中原始的BMSC可在體內(nèi)、外長期生長，可橫向分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。利用BMSC這種可塑性來修復(fù)損傷壞死的心臟組織，在很多動物實驗、臨床試驗中得到了進(jìn)一步證實［8，9］。其機制可能為：（1）BMSC在心臟損傷壞死微環(huán)境作用下橫向分化成心肌細(xì)胞和（或）心肌樣細(xì)胞，并與宿主心肌細(xì)胞形成電-機械偶聯(lián)，進(jìn)而改善心臟功能；（2）BMSC分泌細(xì)胞因子，改善損傷壞死微環(huán)境，促進(jìn)心臟修復(fù)。

表3 兩組間各指標(biāo)均值比較Tab.3 Comparison of mean level between two groups

正常生理狀態(tài)下，外周血中造血祖細(xì)胞僅占單個核細(xì)胞的0.01%～0.1%，約為骨髓的1%～10%。如正常穩(wěn)定狀態(tài)下CD34+細(xì)胞占外周血有核細(xì)胞總數(shù)的0.06%，經(jīng)過G?CSF動員后CD34+細(xì)胞可占外周血有核細(xì)胞總數(shù)的0.75%［10］。據(jù)此，當(dāng)心肌出現(xiàn)急性缺血性損傷壞死時，可通過外源細(xì)胞因子—rhG?CSF的干預(yù)，促進(jìn)其修復(fù)。

本實驗正是基于上述理論及研究背景，建立Wistar大鼠AMI模型，采用外源性細(xì)胞因子動員自體BMSC，通過形態(tài)學(xué)觀察、心臟收縮功能檢測發(fā)現(xiàn)：于造模后48 h，兩組心室肌內(nèi)均可見網(wǎng)格狀灶性壞死，其內(nèi)分布核大深染，胞質(zhì)少的橢圓形、圓形小細(xì)胞浸潤，可能為歸巢的BMSC。造模后1周的STG可見浸潤的圓形小細(xì)胞的胞質(zhì)增多、胞核變小，其排列與周圍的心肌細(xì)胞具有一定的同向性，似轉(zhuǎn)分化的心室肌細(xì)胞，對照組未見此改變。另外分別于造模后第1周、第4周進(jìn)行兩組間心肌損傷壞死面積的比較發(fā)現(xiàn)：STG心肌損傷壞死面積小于對照組（P＜0.05）。綜上分析可能為動員的BMSC歸巢至心室損傷壞死區(qū)，在局部損傷微環(huán)境及細(xì)胞因子作用下向心臟組織分化、減輕了纖維母細(xì)胞的纖維化。另外，已有研究表明BMSC還可促進(jìn)血管新生［11］，改善局部供血，從而改善心功能及預(yù)后，這與本研究在造模后4周進(jìn)行的左心導(dǎo)管檢測結(jié)果相一致：STG的頸動脈內(nèi)血壓、左室內(nèi)壓峰值、左室內(nèi)壓最大變化速率均顯著優(yōu)于對照組（P＜0.01），左室舒張末壓明顯低于對照組（P＜0.01）。

以往大多數(shù)動物、臨床研究多采用先體外培養(yǎng)擴增BMSC，再經(jīng)冠脈內(nèi)、心內(nèi)膜注入心肌。研究表明：干細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)擴增后，其生物學(xué)特性會發(fā)生很大變化，如細(xì)胞體積擴大、體內(nèi)外環(huán)境不同易至細(xì)胞分化、歸巢能力降低等，這些都將影響細(xì)胞移植的效果。而通過細(xì)胞因子啟動自體BMSC進(jìn)行原位移植，不改變BMSC生存內(nèi)環(huán)境、過程簡單、無創(chuàng)傷性，有待進(jìn)一步研究與推廣。

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（編輯 裘孝琦）

Mobilization of Autologous Bone Marrow Stem Cells to Repair Myocardial Injury in Rat

WANG Bo1，TONG Wen?shu2，LI Wen?na1，GUO Xiao?fan1
（1.Department of Cardiology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Cardiovascular Ultrasound，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the repair effect for in?situ transplantation of bone marrow stem cells for acute myocardial injury in rats.Meth?odsAcute myocardial injury model was established by intraperitoneal injection of isoproterenol 10 mg/kg in rat.Autologous bone marrow stem cells were mobilized by cytokine，released and homed to local injured myocardium.A comparative analysis on pathological section between two groups was performed by HE staining and image analysis system.Heart functions were determined by eight lead physiological polygraph system.ResultsThe myocardial necrosis area in in?situ transplantation group was less than that of the control group.The cardiac systolic function was significantly im?proved in in?situ transplantation group compared to the control group.ConclusionAcute myocardial injury model could be established by isoprena?line administration.Myocardial necrosis were repaired and cardiac systolic function was improved by using cytokines.

bone marrow stem cells；acute myocardial injury；rhG?CSF

R541

A

0258-4646（2014）07-0621-04

遼寧省教育廳高校科研計劃（L2010656）

王勃（1969-），女，主治醫(yī)師，博士.

2014-05-13

網(wǎng)絡(luò)出版時間：