明膠肽抗中樞疲勞作用機制的研究

薛海濤，張小強，2

（1.咸陽師范學院體育系，陜西咸陽712000；2.陜西科技大學化學與化工學院，陜西西安710021）

明膠肽抗中樞疲勞作用機制的研究

薛海濤1，張小強1，2

（1.咸陽師范學院體育系，陜西咸陽712000；2.陜西科技大學化學與化工學院，陜西西安710021）

檢測飼養明膠肽與蒸餾水的大鼠進行力竭性游泳運動后即刻紋狀體、間腦及下丘腦等不同部位的多巴胺和5-羥色胺含量，探討明膠肽對多巴胺與5-羥色胺含量變化的調節及抗中樞疲勞功效，為開發高附加值的明膠活性肽產品，擴展豬皮產品的應用范圍提供理論參考，同時為抗中樞疲勞提供新的營養手段。通過負重游泳訓練建立動物疲勞模型，用自制的明膠肽灌胃飼養實施營養干預，用高效液相色譜方法檢測不同腦區單胺類神經遞質的濃度變化并計算DA/5-HT比值，分析、評價自制明膠肽對中樞遞質的調節作用。和灌胃雙重蒸餾水的對照組比較，飼養明膠肽的動物實驗組比值為0.84，對照組為0.14，兩組比較，實驗組比對照組高600%，明膠肽具有明顯的提高DA含量，降低5-HT生成，增強中樞興奮性的功效，可以有效緩解中樞疲勞，增強抗中樞疲勞的能力。

明膠肽；DA/5-HT比值；中樞疲勞

運動性疲勞是發生機制復雜且作用位點眾多的一種生理現象。由于傳統研究方法和測量技術的限制，對運動性疲勞的研究多集中于外周肌肉疲勞方面，中樞神經系統在運動性疲勞中的作用少受重視。近年來的醫學研究證明，針對不同項目和強度誘發的疲勞，運用某些單味中藥、復方中藥或生理活性成分，可使模型動物全腦或不同腦區5-HT、DA等單胺類神經遞質及其代謝產物的濃度發生變化，盡管這些變化在程度、性質、代謝途徑和分子機制等方面還不清楚，但卻說明上述活性成分對調節腦內單胺類遞質及其代謝具有重要作用。隨著新技術的應用和神經生物學研究的發展，運動性中樞疲勞的研究已經取得某些突破性進展。目前的研究表明，長時間運動后，腦組織單胺類遞質可發生改變，影響中樞的興奮與抑制過程，這是導致運動性中樞疲勞的可能機制之一。本文擬通過對模型動物灌胃飼養明膠肽實施營養干預，研究活性肽對神經遞質的調節作用和抗中樞疲勞分子機制，為抗中樞疲勞提供新的營養手段。

1　材料與方法

1.1材料

KM封閉群無菌型大白鼠50只（8周齡），180 g～220 g：購自西安交通大學動物試驗中心。

1.1.2試驗食品與試劑

食品級明膠：山東淄博寶恩生物科技有限公司提供；胰蛋白酶：Wolsen；明膠肽：陜西科技大學食品系分析實驗室用胰蛋白酶水解明膠（酶解工藝條件：pH6.2，酶含量為4%，原料的質量濃度為4%，水解溫度51℃，時間5 h；酶解液用15%TCA除蛋白，超濾膜分離、收集＜10 kDa上清液）；標準品：DA、5-HT（Sigma公司）；標準品溶液配置：以0.01mol/LHCl分別配成濃度為1 g/L的儲備液，置4℃冰箱保存，臨用前稀釋。以DHBA為內標，濃度同上。其余為國產分析純試劑。

1.1.3儀器和試劑

WatersTM600E高效液相色譜儀、16K進樣閥、接5μL進樣環、SIL-6A自動進樣器、AS3120A超聲去氣儀；CTO-6A柱溫箱；SepStikC18微柱（100mm×1mmi.d.，粒徑5μm）；PM-80微流量泵、CHI832電化學檢測器；5011型石墨碳工作電極、參比電極為Ag/AgCl，參比電極的電位分別設置為+0.72 V（氧化）和+0.05 V（還原），靈敏度均為5 nAFS；4.6mm×150mm色譜柱，填料5μm Hypersil BDS（大連依利特科學儀器有限公司）；檢測電壓為700μV，靈敏度為5 nA；Scientific software Ezchromelite分析軟件；0.45μm濾膜及抽濾器（Millpore）；Biofuge28RS高速冷凍離心機（Heraens）；Soniprep150超聲破碎儀（Sanyo）；0.2mGHP耐酸樣品處理器（Pall）；PelletPestile電動勻漿儀（Kontes）；SN-2型立體定位儀（Narishige）。

1.2方法

1.2.1大白鼠分組飼養、日常運動訓練、力竭性負重游泳實驗

二是社會監督體系不健全。鄧小平總結黨在社會主義建設過程中過去發生的各種錯誤，指出這些錯誤的發生與我國法制不健全和社會監督制度缺失有關。因此，鄧小平非常重視制度建設，認為制度在規范社會行為、完善社會監督方面具有根本性、長期性、穩定性和全局性。

按照體重隨機分成2個組，對照組和試驗組。且每組要多養3～5只預防灌胃或者運動訓練時溺水發生意外。日常自由采食飲水，灌胃飼養28 d，灌胃時間安排在運動前2 h，對照組灌胃雙重蒸餾水，試驗組給予明膠肽，飼養量為動物體重的3%。每天游泳訓練一次，每次20min，水深100 cm，水溫（30±2）℃，不負重。末次灌胃2 h后，安排大白鼠負重3%進行游泳運動，負重方式應用食品包裝膜包裹橡皮泥，再用棉線系在小鼠尾部的模式，待其頭部沉入水中10 s不能自己浮出水面為力竭性疲勞，采樣檢測。

1.2.2樣品的提取和凈化

采用剪刀斷頭，直接取腦的方法，利用定位儀劃分腦區，取出的腦組織用冰生理鹽水沖洗，不但使酶活性迅速降低，而且方便腦組織的分區。實驗大鼠分別于安靜狀態和運動疲勞后即刻斷頭處死，迅速打開顱腔，取出全腦，在冰面上取紋狀體、海馬、皮質、下丘腦、小腦和腦干等部位腦組織，用冰生理鹽水沖洗后濾紙吸干，稱重后用10倍的預冷100 g/L磺基水楊酸處理，置1.5mL離心管中充分勻漿，加入組織裂解液（0.01%半胱氨酸，0.2 mmol/L HClO，0.5 mmol/L EDTA），再次放置在1.5mL離心管中充分勻漿，然后超聲破碎兩次，離心15min（14 000 r/min，4℃）；取上清液置另一離心管中，按1：5比例加入冰冷的0.1mol/L的高氯酸溶液,低溫離心30min（10 000 r/min，4℃）1次，取上清液，沉淀蛋白質后冷凍離心，將上清液置-80℃液氮凍存待測。測樣品時，將樣品冰上融化后離心過0.2mmol/L的耐酸過濾器。取上清液由自動進樣器進樣。采用高效液相色譜電化學檢測多巴胺、5-羥色胺等神經遞質含量。實驗數據采用SPSS11.5軟件進行統計、分析，P為0.05。

1.2.3樣品測試

20世紀90年代生理學家把環磷腺苷（cAMP）稱為第二信使；如今又把單胺類神經遞質稱作第三信使。單胺類遞質包括兒茶酚胺類和吲哚胺類，前者研究較多和較早的有多巴胺（DA）；后者主要包括5-羥色胺（5-H T）。它們是高等動物和人類中樞神經重要的信息傳遞物質，準確檢測其在腦組織的含量，研究其生理功能，對于判斷中樞神經系統的功能和狀態等具有重要的意義。但由于單胺類遞質從神經元末梢釋放后，迅速代謝或重攝取，使這些遞質的組織收集液濃度非常低，加之自身化學性質不穩定，生物結構具有相似性，以及可能存在的內源物干擾，檢測很不容易。自1978年Hallman等[1]首先報道用高效液相色譜法（HPLC）檢測血漿中兒茶酚胺以來，國內外已有許多改良方法問世[2-3]。常見測定方法主要有電化學檢測法、生物法、高效液相色譜熒光檢測法、毛細管電泳法、氣相色譜、放射示蹤等，但這些方法對樣品的處理比較復雜，測量成本和儀器設備的要求很高，而且耗時較多。用同樣的方法一次處理樣品同時測定多種神經遞質的方法更是少見。Meeusen[4]等采用反相高效液相電化學色譜法（rP-HPLC-ECD）使得測定時間大大縮短，靈敏度提高。趙煥英[5]通過對樣品的預處理，建立了一種能在簡單配置HPLC-ECD儀上同時測定多種單胺類物質及其代謝產物的方法。葉惟泠[6]的研究證實應用微柱液相色譜-雙電極電化學法檢測、分析腦中的單胺類遞質具有省溶劑和增加靈敏度的優點。本研究借鑒現有研究成果，經反復實驗，設計以下檢測方案。

1.2.3.1樣品的預處理

選擇有效地樣品預處理方法是成功地應用高效液相色譜法測定各類神經遞質的關鍵。經預實驗最終確定0.2mol/LHClO為組織樣品提取單胺類遞質的蛋白變性劑；同時添加0.01%半胱氨酸和0.5mmol/L Na2EDTA，達到減少溶質被氧化破壞的目的。操作過程中為減少由研磨程度不均引起的遞質含量提取差異，對組織勻漿后的樣品進行適度的超聲破碎；在4℃、15min（14 000 r/min）條件下離心后再用耐酸的GHP 0.2m過濾器處理。

1.2.3.2色譜條件的選擇和優化

柱溫：30℃；進樣量：20mL；工作電位選擇在0.6 V。經反復實驗選擇pH=5.0、濃度0.1mmol/L的檸檬酸/檸檬酸鈉為緩沖液，流量為0.4 g/L；甲醇作為流動相有機劑，其中甲醇含量為8%（體積分數）；流速為1.0mL/min。考慮到單胺類遞質及代謝產物的混合物用簡單非梯度洗脫系統難以有效分離，本實驗將1-庚烷磺酸鈉加人檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液，同時為穩定pH及防止樣品峰拖尾加入適量的5mmol/L二三乙胺，結果顯示2種單胺類遞質實現了較好的分離。多巴胺及5-羥色胺含量采用美國Waters公司的配套軟件Millennium32自動控制積分測定峰面積計算、內標法定量。

2　結果分析與討論

2.1明膠肽對DA的調節作用和抗中樞疲勞功效

DA是腦內一種重要的單胺類神經遞質，血液中的Tyr進入腦內后轉運至DA神經元內，主要在黑質產生。合成后的DA沿黑質-紋狀體投射系統分布，儲存在紋狀體DA神經末稍的囊泡中。主要作用是調節肌緊張，使機體作好運動的準備，并在大腦皮質的信號刺激下“啟動”某一動作，屬于一種興奮性神經遞質。現代醫學研究[7]表明黑質-紋狀體中DA的減少會導致運動的抑制。Bailey[8]的研究表明，1 h適量運動后，大鼠腦內多部位DA及其代謝產物增加，但3 h運動至疲勞后卻降低。宋亞軍[9]的研究發現，大鼠一次性力竭游泳3 h運動后即刻，間腦DA顯著降低。而急性耐力運動后，間腦、端腦DA濃度降低，腦干有升高趨勢，DA水平變化表現出區域特異性。Chaouloff[10]的研究發現，以60%～65%VO2max運動1 h后，大鼠腦內DA水平增高；在運動至疲勞的運動中，隨著疲勞的形成與發展，DA水平趨于降低；預示運動鼠腦內DA合成與代謝得以維持時，可推遲運動性疲勞的出現。整體上來說大腦DA與激發促動、肌肉協調能力及耐力運動成績密切相關；對神經系統的電活動有興奮作用，維持腦內較高的DA水平有助于延緩疲勞的發生[11]。本實驗通過對模型動物灌胃飼養明膠肽，檢測了不同腦區對這種營養干預的反應，結果如表1所示，實驗組和對照組相比，不管安靜態還是疲勞態，在檢測的所有腦區實驗組DA含量均高于對照組；但各個腦區對營養干預的反應并不一致，DA升高程度存在一定差異；運動后變化幅度也非線性降低，其中海馬區反應最為敏感，實驗組比對照組提高了254%；中腦、腦干的變化缺乏統計學差異；端腦、下丘腦和紋狀體DA運動前后的比值含量仍舊高于對照組。提示明膠肽通過不同程度提高模型動物不同腦區的DA含量，有可能延緩疲勞的發生，端腦、下丘腦和紋狀體前后反應一致。結合我們[12]前期的研究工作，明膠肽不僅具有抗外周疲勞的功效，也可能通過調節興奮性遞質水平的方式，延緩中樞疲勞的發生。

表1　大鼠不同腦組織安靜態、疲勞態DA的平均值和標準差（n= 10，ng/g，x±S）Table1 Concentration of DA on the rat from the different tissue（n=10，ng/g，mean±SD）

2.2明膠肽對5-HT的調節作用和抗疲勞功效

5-羥色胺是腦內廣泛存在的一種抑制性單胺類神經遞質，主要作用是抑制下丘腦因子的釋放，而這些因子可控制垂體激素的釋放率，通過下丘腦-垂體-腺體軸的調節影響血液相應激素水平，使機體運動能力下降[13]。同時，腦內5-HT增加可降低體溫調節功能、抑制心血管活動、增強嗜睡感等，而這些機能又與肌肉疲勞感密切相關；進而影響機體的運動能力，引起運動性疲勞的發生，是中樞疲勞的可能性介質[14]。Newsholme[15]研究了中樞5-HT的作用與變化，發現腦內5-HT增加能損傷長時間運動中神經系統的功能，引起運動能力的下降，并據此首次提出了“中樞疲勞”的假設。藥物介導的實驗表明[16]，使用5-HT促進劑可降低耐力運動成績，引起疲勞提前出現；而5-HT拮抗劑實際上能推遲疲勞的產生。Davis[17]通過研究認為5-羥色胺可抑制多巴胺能系統，并且這種效應因為多巴胺能系統的損傷或功能減弱變得更加顯著；他還進一步證實，5-HT腦部合成增加，可增強中樞神經系統對其它疲勞信號的敏感性，使機體運動能力降低。Chaouloff[10]對運動后大鼠大腦不同部位5-HT水平的實驗研究發現，1 h跑臺跑（20m/min）可導致中腦、海馬、紋狀體5-HT增加，其它腦區無明顯變化；說明跑臺跑可增加運動鼠特定腦區5-HT的合成與代謝。他們的研究結果顯示，超長運動可使下丘腦等腦區5-HT水平提高，誘發運動性疲勞的產生。宋亞軍等[9]的研究顯示，3 h游泳運動后即刻，大鼠間腦和腦干5-HT濃度增高；其中，間腦5-HT質量分數增加（23.15%）顯著，端腦則略有降低。表明各腦區5-HT對急性耐力運動的反應存在差異；提示，在急性耐力運動中，中樞疲勞的可能性介質（5-HT）水平的提高可能發生或首先發生在某些腦區，而非全腦，其變化情況可能與運動持續時間、運動強度及運動方式等因素有關。Blomstrand等[18]對2 h跑臺運動（平均17m/min）后大鼠不同腦區的研究表明，無訓練大鼠下丘腦5-HT濃度顯著增高，海馬、紋狀體和腦干有增高趨勢，而皮質和小腦表現為輕微降低，超長適量運動和力竭性運動可增加腦內各部位5-HT的合成與更新。Newsholme[19]采用微透析技術對大鼠海馬5-HT變化的研究顯示，從跑臺跑（25m/min）60min開始5-HT表現為增加，120min的運動結束達到最高。洪煜[20]通過游泳模型采用高效液相分析檢測取得了類似的結論。總之，5-HT的變化和中樞疲勞緊密相關，并具有一致性。我們的營養干預實驗結果如表2所示，在安靜態，明膠肽可以不同程度降低實驗組動物腦內不同功能區5-HT水平，使動物保持較高的興奮性；疲勞后，和對照組比較，實驗組除皮質和端腦外，其余功能區5-HT含量同樣低于對照組，尤以海馬、下丘腦和紋狀體差異顯著，具有統計學意義。這個結果顯示，明膠肽對中樞功能具有穩定功能，可以減少或延緩運動刺激帶來的遞質水平變化，從而產生抗中樞疲勞功效。

表2　大鼠不同腦組織安靜態、疲勞態5-HT的平均值和標準差（n=10，ng/g，x±S）Table2 Concentration of 5-HT on the rat from the different tissue

2.3明膠肽抗中樞疲勞機制的分析

中樞系統作為自然界最復雜的反饋和控制系統，特異性功能神經元細胞在腦內的分布廣泛重疊，動態聯系；依據泛腦網絡理論，中樞系統的特定功能區可以定位在相對間隔的一定部位；也可能呈序列排布的網狀分子結構；這種多級神經元間的序列排布可引起遞質之間紛繁的生理效應等[7]。目前的研究[11]發現紋狀體、中腦及下丘腦內不僅含有較為廣泛的單胺類神經元，紋狀體與中腦黑質及下丘腦還存在著傳入、傳出聯系；現有研究表明紋狀體是控制、調節運動的一個重要中樞，下丘腦與行為的適應密切相關；它們所釋放的遞質多巴胺、5-羥色胺可能互相影響，互相制約，支配著中樞的相同或不同的部位，伏隔核后部的5-HT受體的激活可刺激DA的釋放，而紋狀體的5-HT可抑制DA能系統。另一方面，雖然通過實驗發現[21]，中樞5-HT和DA等遞質濃度變化是影響運動性疲勞的重要神經生物學因素，但多數報道只是對局部腦區，或者是某些神經功能團進行研究。因此，對運動中單胺類遞質變化的認識應從不同層次、不同水平加以整和，以求更全面地理解中樞疲勞的形成機制。

單胺類遞質從突觸前膜釋放后，主要是通過重攝取而滅活。給大鼠食用5-羥色胺重攝取抑制劑氯米帕明后，發現紋狀體多巴胺活性水平升高，說明5-羥色胺含量的升高，可以促進多巴胺的重攝取作用[22]。王斌[23]的實驗表明不管是力竭運動后即刻，還是在運動后24 h，中腦和下丘腦DA的變化是相同的；下丘腦內的5-HT水平的變化與DA的變化有相反的趨勢，預示下丘腦的活動可能受DA和5-HT共同抑制。更多研究[24]表明，紋狀體中的DA的增加，與中腦和大腦皮質中5-HT增加相伴發生。類似的實驗[25]顯示中腦多巴胺/5-羥色胺比值在運動后即刻升高，運動后下降，運動后即刻及運動后下丘腦多巴胺/5-羥色胺比值持續保持較低水平，提示運動后即刻中腦處于興奮狀態，下丘腦則可能是一種持續的抑制。疲勞時，5-羥色胺含量在運動后比安靜時顯著升高，在紋狀體和中腦疲勞的延續期升得更高。腦中的多巴胺在運動后即刻顯著升高，在之后逐漸降低。這些研究表明腦內的高多巴胺/5-羥色胺比值可能通過增加喚醒動機、提高神經肌肉的興奮性和協調性等增強行為能力；而低多巴胺5-羥色胺比值可能通過減弱促動作用、降低運動動機、誘發心理疲倦、導致失眠等降低行為能力，即構成中樞疲勞。因此，有學者研究用它們之間的比值來分析它們之間的關系。正常機體的運動調節有賴于DA和5-HT的平衡。

運動性疲勞是一個外周與中樞協同交互作用的復雜過程，其中一類神經遞質的變化并不能很好地反映中樞的興奮與抑制狀態。研究發現，超長運動中所產生的疲勞與腦內5-HT增加和DA降低相關[26]。所以，我們采用DA/5-HT比值來描述二者在運動疲勞形成和發展過程中的可能關系，結果如表3所示，雖然大鼠各個腦區DA、5-HT的代謝狀況、運動前后的變化程度等并非完全一致。其中明膠肽的干預效果在端腦、間腦、下丘腦、紋狀體等部位表現更加顯著；提示紋狀體等部位可能是長時間運動中樞疲勞的敏感性區域；即長時間耐力運動可能會首先引起紋狀體單胺類遞質的變化，造成運動能力的降低，并引起運動性疲勞的形成與發展。但總體而言，各個腦區的DA/5-HT比值，不管是安靜態還是疲勞肽均是實驗組高于對照組。顯示明膠肽可能通過協調不同遞質的代謝水平，減少或延緩神經遞質的劇烈變化，穩定中樞功能的穩態達到抗中樞疲勞的功效。

3　結論

許多學者認為，運動性疲勞的產生可能與運動類型有關，短時間劇烈運動時出現的疲勞往往與疲勞的外周機制相關；而長時間中等強度運動產生的疲勞，則以中樞系統的保護性抑制為主。本實驗結果說明在運動性疲勞的發生過程中神經系統不同部位的調控發揮著特定作用，與現有結果一致。從單胺類神經遞質的變化看，大鼠中樞系統的抑制與紋狀體、腦干和下丘腦等部位DA和5-HT含量的變化聯系密切，運動導致的中樞系統的抑制在不同部位并非完全一致，這個過程可能首先發生在某些腦區，而不是在全腦均衡發生的。多巴胺和5-羥色胺在某些腦區有相對的獨立性，但更多的則是同時起作用，正常的運動有賴于單胺類神經遞質及其它多種遞質的功能平衡。其中多巴胺和5-羥色胺之間的平衡可能是維持耐力運動能力的重要因素，通過穩定它們之間的平衡可有效削弱疲勞的發生。

表3　各組實驗大鼠運動前后不同腦區DA/5-HT比值Table3 Value of DA/5-HT in rat

依據目前的研究成果，不少學者通過補充支鏈氨基酸、糖類、牛黃酸、不飽和脂肪酸等營養手段和方法來推遲運動能力下降和延緩運動性疲勞的產生；對于補充活性肽延緩中樞疲勞還少有研究，通過我們的實驗，對模型動物補充明膠肽后，各腦區DA分解代謝水平普遍提高，以海馬區提高最為明顯，而5-HT的變化與DA比較并不一致。為深入探討單胺類遞質之間的相互關系以及對疲勞的影響，我們進一步觀察了不同腦區運動前后DA/5-HT比值的變化。實驗顯示當運動性疲勞發生時，全腦的DA/5-HT比值降低，腦內的抑制過程占優勢，并伴有中樞疲勞的發生。細化分析，DA/5-HT比值海馬、下丘腦和紋狀體等部位顯著性降低，提示上述部位可能是長時間耐力運動中樞疲勞的敏感性區域，可考慮將DA/5-HT比值作為研究和評定運動性中樞疲勞的客觀指標之一，同時在抗疲勞食品研發中可添加明膠肽增強功效。

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Study to Gelatin Peptide on Anti-fatigue of Central Nervous System

XUE Hai-tao1，ZHANG Xiao-qiang1，2
(1.Depertment of P.E.Xianyang Normal University，Xianyang 712000，Shaanxi，China；2.College of Chemistry& Chemical Engineering Shaanxi University of Science and Technology，Xi'an 710021，Shaanxi，China）

This study was designed to observe the changes of DA and 5-HT in hypothalamus，diencephalon，corpus striatum of rats．We want to screen the effect of anti-fatigue active peptides，and the adjustability to content of DA and 5-HT.To develop the high value-added products of pigskin gelatin bioactive peptide，expanse the scope of application of the product，at the same time to provide experimental data for the method of nutrition recovery.We established animal fatigue model for load swimming training，feed gelatin peptide to mice for nutrition intervention，use the microdialysis technique to extract central neurotransmitters from fatigue animal midbrain，use reversed phase high performance liquid chromatography to detect the changes of monoamine neurotransmitter concentration and calculate the ratio of DA/5-HT.Finally，we evaluated self-made gelatin peptide to delay and moderate of central fatigue.Result of experiment:Compare to control group of feeding double distilled water，DA/5-HT of animal experimental group was 0.84，control group was 0.14.Comparison of these two groups，the experimental group was 600% higher than the control group.Gelatin peptide had obviously increased the content of DA，decreased generation of5-HT，enhanced the effect of central excitatory，alleviated the central fatigue and enhanced the ability of anti-fatigue sport.

gelatin peptide；DA/5-HT；central fatigue

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.16.002

咸陽師范學院專項科研基金項目（13XSYKY065，13XSYKY062）

薛海濤（1979—），男（漢），講師，碩士，研究方向：體育教學與訓練。