小分子半抗原直接包被ELISA用于蝦肉氯霉素檢測

賽娜，吳蘊棠，孫忠，烏蘭圖雅，黃國偉，*

（1.天津醫科大學公共衛生學院營養與食品衛生學系，天津300070；2.錫林郭勒職業學院信息技術工程系，內蒙古錫林浩特026000）

小分子半抗原直接包被ELISA用于蝦肉氯霉素檢測

賽娜1，吳蘊棠1，孫忠1，烏蘭圖雅2，黃國偉1，*

（1.天津醫科大學公共衛生學院營養與食品衛生學系，天津300070；2.錫林郭勒職業學院信息技術工程系，內蒙古錫林浩特026000）

探討新型氨基化小分子半抗原直接包被ELISA方法檢測食品中氯霉素殘留的可行性。采用氨基化氯霉素直接包被在經戊二醛活化后的酶標板表面，并通過生物素-鏈霉親和素放大系統進一步提高該檢測方法的靈敏度。結果表明，氨基化小分子半抗原直接包被ELISA的靈敏度和最低檢出限分別為12.9ng/ML和0.7ng/mL，CV%為1.8%~4.5%。新型氨基化小分子半抗原直接偶聯ELISA具有靈敏度高，干擾少，檢測步驟簡便、操作安全，測定結果較準確可靠。

小分子半抗原；直接包被；ELISA

氯霉素（chloramphenicol，CAP）是一種常見的廣譜抗菌藥，在高濃度時有很好的殺菌作用，在低濃度時能抑制多數細菌的生長，因此該抗生素在臨床上廣泛使用。對其敏感的細菌主要有克雷伯氏桿菌、大腸桿菌、巴氏桿菌、產氣桿菌、傷寒桿菌等。隨著氯霉素應用的增加以及科學技術的發展，氯霉素已被證明對機體有非常大的毒副作用，如遺傳毒性，骨髓造血機能抑制毒性，生殖毒性，神經毒性，灰嬰綜合癥等。此外，長期微量攝入氯霉素不僅使大腸桿菌、沙門氏菌等產生抗藥性，而且還會導致機體正常菌落失調，使人們易患各種疾病。由此可見，氯霉素在動物性食品中的殘留，通過水產品、肉制品、奶、蛋等作用于人類，使人們的健康在受到威脅。對此，聯合國糧農組織、世界衛生組織和眾多國家規定限制或禁止氯霉素用于食品動物[1-2]，中國農業部已將氯霉素從2000年版《中國獸藥典》中刪除并列為禁藥。而歐盟的進口食品衛生標準是：在進口動物產品中不得檢出氯霉素，其“不得檢出”的含義是氯霉素量在1μg/kg以下。2002年歐盟對我國出口到歐盟的動物源性產品實行禁運，就意味著我國將在歐盟市場丟掉13萬噸的市場份額和造成6億多美元的經濟損失[3]。并且由于歐盟的禁令，美國和日本等國已高度關注我國出口水產品的質量。因此動物性食品中氯霉素的殘留量分析，尤其是快速、準確、高靈敏度的檢測方法，近年來得到國內外食品分析工作者的高度關注[4]。

目前氯霉素殘留檢測的方法主要有免疫學方法、色譜分析方法和微生物學方法。微生物法耗時長、重復性差、靈敏度低；色譜分析法需要昂貴的儀器，對檢測技術人員要求高，樣品前處理較為煩瑣，成本較高，分析速度較慢，很難達到快速、簡便和現場檢測要求，更難以適應大量復雜樣品的檢測。而免疫分析方法，尤其是ELISA技術，一方面具有簡單、快速、靈敏度高、特異性強、分析容量大等優點，另一方面它對使用人員的技術要求不高也不需要貴重儀器設備[5-6]。

基于氨基化小分子半抗原與酶標板表面直接偶聯技術以及生物素-鏈霉親和素放大系統建立一種氨基化小分子半抗原直接包被ELISA方法，用于檢測蝦肉中的氯霉素殘留量，并與傳統ELISA法、高效液相色譜法（HPLC）進行比對，以驗證該方法的準確性。

1 材料和方法

1.1 材料

氯霉素標準品、琥珀氯霉素、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、N－羥基琥珀酰亞胺（NHS）、二環乙基碳二亞胺（DCC）等購自美國Sigma-Aldrich公司。抗氯霉素抗體購自美國Abcam公司。MK3酶標儀購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 氯霉素-BSA偶聯物、氨基化氯霉素和生物素化抗體的制備

稱取18.4mg琥珀氯霉素、8.5mgDCC和4.8mgNHS溶解于2mLDMF中，緩慢振搖反應12 h，15 000 r/min離心8min后去除沉淀物。將上清液緩慢滴加到BSA（10mL，10mg/mL）溶液中，4℃反應過夜，然后將反應液置于PBS緩沖液（0.01mol/LPBS）中透析3 d，透析產物冷凍干燥后低溫保存，即可獲得氯霉素-BSA偶聯物。

稱取氯霉素67mg溶于700μL無水乙醇中，緩慢加入34mg鋅粉，攪拌40min。反應結束后10 000 r/min離心8min除去沉淀物，進而獲得氨基化氯霉素。

將BNHS溶解于DMF中配制成1mg/mL溶液，用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液將抗體稀釋至0.1mg/mL，將上述兩種溶液按體積比為10∶1.5混合，室溫下振蕩反應4 h。反應結束后透析除去多余的生物素，即獲得生物素化抗體。

1.2.2 氨基化小分子半抗原的直接包被ELISA

使用0.01mol/L，pH9.6碳酸鹽緩沖液將6.5%戊二醛（GA），加入到中度吸附微孔板中，每孔200μL，37℃孵育1.5 h。洗滌液（PBST）洗滌5次。用PBS緩沖液將氨基化氯霉素稀釋成適當濃度加入到微孔板中，37℃孵育1.5 h。PBST洗滌后，加0.15mol/L的氨基己酸溶液，37℃孵育1.5 h。洗滌后干燥保存。加入含有0.05%BSA的PBS（0.01 mol/L）溶液，每孔150μL，37℃反應1.5 h，傾去封閉液，拍干。加入適當濃度的生物素化抗體，100μL/孔，37℃孵育1.5 h。PBST洗滌四次后，每孔加入100μLHRP-標記親和素，37℃孵育45min。PBST洗滌6次，每孔加100μL底物顯色液，37℃孵育10min后每孔中加50μL 2mol/LH2SO4終止反應后，用酶標儀進行讀數。傳統ELISA步驟如Sai etal.[7]文章所示。

1.2.3 蝦肉中氯霉素的提取和含量分析

氯霉素殘留在水產品中廣泛存在，本實驗選用蝦肉樣品，分析樣品中氯霉素殘留狀況。

1.2.3.1 免疫分析樣品的前處理

準確稱取4 g勻漿處理后的蝦肉樣品，加入10mL乙酸乙酯，震搖20min，6 000 r/min離心30min。取上清液用氮氣吹干，加入2mL異辛烷/氯仿混合液（3∶2，v/v）以及2mLPBS（0.01mol/L，pH 7.4）溶解，混合液振蕩2min，3 000 r/min離心10min，取上清液直接用于酶聯免疫分析。

1.2.3.2 HPLC方法的樣品前處理

準確稱取4 g勻漿處理的蝦肉，加入10mL乙酸乙酯室溫下振蕩20min，6 000 r/min離心10min，取上清液用氮氣吹干，固體殘渣使用4mL色譜純甲醇溶解用于HPLC分析。

1.2.3.3 高效液相色譜分析條件

色譜柱：C18（250×4.6mm，5μm）；

進樣體積：50μL；

流動相：甲醇-水（65∶35，V/V）；

流速：0.8mL/min；

檢測波長：278 nm。

2 結果與分析

2.1 氯霉素-BSA偶聯物的鑒定

通過紫外吸收圖譜和質譜測定氯霉素、BSA和氯霉素-BSA偶聯物。紫外吸收圖譜中可知，氯霉素-BSA偶聯物最大吸收峰位在278 nm處，與氯霉素最大吸收峰位基本相同，可初步判斷氯霉素和BSA偶聯成功。進一步質譜分析中可知，氯霉素-BSA偶聯物分子量（76880）比BSA分子量（66997）有明顯增大。由此可見，氯霉素-BSA偶聯物制備成功。

2.2 氨基化小分子半抗原直接包被ELISA的檢測靈敏度

表1分別表示了傳統ELISA以及氨基化小分子半抗原直接包被ELISA的檢測靈敏度。

表1 氨基化小分子半抗原直接包被ELISA和傳統ELISA的檢測靈敏度Tab le1 Sensitivitiesof BSAS-direct Hapten coated ELISA and conventionalELISA

從中可得出，氨基化小分子半抗原直接包被ELISA和傳統ELISA的靈敏度分別為12.9 ng/mL和70.6 ng/mL，最低檢出限分別為0.7 ng/mL和6.3 ng/mL。由此可見，氨基化小分子半抗原直接包被ELISA的檢測靈敏度顯著高于傳統ELISA。其原因可能有以下幾點。首先，在傳統ELISA中，氯霉素分子較小，與抗體反應的識別位點比較單一，與載體蛋白偶聯過程中其特異性識別位點易被屏蔽，進而失去其結合的高親和性。其次，在傳統ELISA中，完全抗原是通過與聚苯乙烯表面的疏水作用力完成偶聯，而此過程很可能引起載體蛋白空間結構發生變化，如疏水性基團大量暴露，導致小分子半抗原和抗體識別能力下降。而在氨基化小分子半抗原直接包被ELISA中，將氨基化小分子半抗原直接包被到微孔板表面的方式不但能夠避免載體蛋白屏蔽作用，同時經戊二醛反應后的微孔表面形成網絡結構起到連接臂作用，加大小分子半抗原與酶標板之間的空間距離，有利于小分子半抗原特異性識別位點暴露，有利于抗體和小分子半抗原的識別。此外，生物素-親和素信號放大系統的使用，進一步提高檢測靈敏度[7-8]。

2.3 氨基化小分子半抗原直接包被ELISA的檢測特異性

表2為氯霉素抗體對四種結構類似物的交叉反應率，對其它幾種結構類似物交叉反應率均小于1%。兩種ELISA方法得到結果一致，表明該方法具有較高的特異性。

表2 氯霉素類似物的交叉反應率Tab le2 Cross-reactivitiesof the inhibition assayw ith selected coMpounds%

2.4 實際樣品分析

為探討氨基化小分子半抗原直接包被ELISA方法的適用性和有效性，我們將這種方法用于實際樣品（蝦肉）中氯霉素殘留的檢測，并與傳統ELISA、HPLC等方法進行對比，結果見表3。

表3 蝦肉中氯霉素殘留的三種檢測方法（n=3）Table3 Resu lts froManalysisofCAP in samp lesby BSAS-direct hapten coated ELISA，conventional ELISA and HPLC Method（n=3）

由表3可知，三種方法檢測結果基本一致，同時氨基化小分子半抗原直接包被ELISA的CV值在1.8%～4.5%之間，小于其它兩種方法，呈現出更高的精確度和穩定性。由此可以表明這種新型ELISA模型可用于實際樣品中獸藥殘留檢測。

3 結論

通過戊二醛對聚苯乙烯微孔板進行處理，在微孔板表面產生帶有醛基基團的網絡結構，通過醛基與氨基化氯霉素的氨基反應，從而將氨基化小分子半抗原直接包被到微孔板表面。同時采用了生物素-鏈霉親和素放大系統，可建立一種新型的氯霉素檢測ELISA。該方法不僅避免小分子半抗原與大分子蛋白偶聯的繁瑣過程，而且其最低檢出限（0.7 ng/mL）比傳統ELISA最低檢出限（6.3 ng/mL）提高了近9倍。將該新型的ELISA技術應用于實際樣品中氯霉素殘留檢測，該方法具有較高的精確度和穩定性。由此可見，這種氨基化小分子半抗原直接包被ELISA方法在農藥、獸藥殘留分析應用具有較大的潛力。

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AMination SmallMolecular Hapten Coup led Directly ELISA for the Detection of Chloramphenicol in Shrimp Samp les

SAINa1，WUYun-tang1，SUNZhong1，WU Lantuya2，HUANGGuo-wei1，*
（1.DepartmentofNutrition and Food Hygiene，Schoolof Public Health，Tianjin MedicalUniversity，Tianjin 300070，China；2.Information Technology Engineering Department，XilingolVocationalCollege，Xilingol026000，InnerMongolia，China）

The novel ELISA was developed for monitoring chloramphenicol remains in food by the directly attaching smallmolecule haptenwith amino groups to themicrotiter plate surface.chloramphenicolwith aminogroupswasdirectly coated on thesurfaceofmicrotiterplatesby treatingwith glutaraldehydesolution，and biotinstreptavidin systeMwasemployed to improve thesensitivityofimmunoassay.Thesensitivityof thenew ELISAwas 12.9 ng/mL，CV%was1.8%-4.5%.The novelamination smallmolecule hapten coupled directly ELISA has manyadvantages，suchashigh sensitivity，lessinterference，simpleoperationand soon.

Smallmolecularhatpens；Directly coated format；ELISA

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.18.017

2014-09-15

國家自然科學基金青年科學基金項目（81302430）；中國博士后科學基金面上資助項目（2014M560192）和天津市高等學校科技發展基金（20110143）

賽娜（1983—），女（蒙古），講師，博士，研究方向：營養與食品衛生學。

*通信作者：黃國偉（1962—），男（漢），教授，博士，研究方向：營養與食品衛生學。