馬奶酒樣乳桿菌ZW 3在豇豆發酵中的應用

鄭永娜，趙勇，王菁蕊，王艷萍，*

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，食品營養與安全教育部重點實驗室，天津300457；2.天津市和平區南市街社區衛生服務中心，天津300457）

馬奶酒樣乳桿菌ZW 3在豇豆發酵中的應用

鄭永娜1，趙勇2，王菁蕊1，王艷萍1，*

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，食品營養與安全教育部重點實驗室，天津300457；2.天津市和平區南市街社區衛生服務中心，天津300457）

研究了馬奶酒樣乳桿菌ZW3以不同比例與植物乳桿菌299和乳酸菌723復配用于豇豆的發酵，在接種量一定的情況下，隨著馬奶酒樣乳桿菌ZW3所占比例的增大，酸豆角的pH降低，酸度增加；以感官評分作為指標，確定3種菌以1∶1∶1比例復配發酵時，酸豆角口味最佳。通過有機酸與揮發性風味物質分析，結果顯示以1∶1∶1比例接種發酵的酸豆角與自然發酵的酸豆角中的有機酸與揮發性風味物質在種類與含量上基本一致。將馬奶酒樣乳桿菌ZW 3用于發酵泡菜，泡菜pH值下降快、產酸率高、風味純正。

馬奶酒樣乳桿菌ZW3；酸豆角；產酸；風味物質

豇豆含豐富VB、VC和植物蛋白質，具有多種功效，如《本草綱目》就有記載，“豇豆理中益氣，補腎健胃，和五臟，調營衛，生精髓。止消渴，吐逆，泄痢，小便數，解鼠莽毒[1]。”在我國長豇豆種植分布面積廣，全國各省市區均有種植[2]。豇豆的集中產出就會使其大量的積壓，最終導致變質，不僅給農民造成了極大的損失，而且還造成大量的浪費。豇豆經乳酸菌發酵制成酸豆角可解決豇豆的閑置問題。酸豆角作為泡菜的一種，具有悠久的歷史，其制作可以追溯到兩千多年前[3]。酸豆角的酸味濃郁、口味醇厚、營養易于吸收，同時還具有開胃理氣，降低膽固醇，控制皮膚老化及改善皮膚效果，抗癌，增強免疫力等功能特性[4]。

我國現階段酸豆角的生產仍然以家庭式天然發酵為主[4]，乳酸發酵緩慢，發酵周期較長，酸味較弱，并且受環境因子影響也很大，產品質量不穩定，同時亞硝酸鹽含量在很大程度上得不到有效的控制。這些不利因素很大程度上制約著酸豆角的工業化生產。純乳酸菌接種已成為近些年發酵研究的重點，它在克服自然發酵不足的同時，也推動著泡菜的工業化發展[3]。所以，針對酸豆角工業化生產現狀，篩選出產酸能力強，發酵特性優良的菌種極為重要。

本實驗將新分離出的菌種——馬奶酒樣乳桿菌ZW3[5]用于酸豆角發酵，研究了其與其它乳酸菌混合發酵過程中，不同比例接種馬奶酒樣乳桿菌ZW 3對產酸的影響，以及含馬奶酒樣乳桿菌ZW3的發酵與自然發酵相比，有機酸，揮發性風味物質，感官上的差異，為酸豆角工業化生產提供技術依據與理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新鮮豇豆、白砂糖、食鹽等均購于當地市場。

菌種：植物乳桿菌299（Lactobacillus plantaruM299）、乳酸菌723（Lactic acid bacteria 723）、馬奶酒樣乳桿菌ZW3（Lactobacillus kefiranofaciens ZW3），保藏于天津科技大學食品工程與生物技術學院食品生物技術實驗室。

1.2 主要儀器與試劑

泡菜壇：天津市農貿市場；HFsafe900型超凈工作臺：上海力申科學儀器有限公司；全自動高壓滅菌鍋：日本Yamato公司；LRH-250生化培養箱：上海-恒科技有限公司；DY-2厭氧培養箱：浙江冷凍機總廠；DELTA-320 pH計：瑞士梅特勒-托利多公司；L710A型高效液相色譜儀：日本島津公司；GC-MS-4000氣相色譜-質譜聯用儀：美國VARIAN公司。

MRS液體培養基[6]；改良MRS液體培養基：酵母粉45.0 g，葡糖糖16.0 g，乳糖4.0 g，NaCl0.15 g，K2HPO40.5 g，半胱氨酸鹽酸鹽1.4 g，乙酸鈉15.0 g，Tween-80 1 g，MnSO40.2 g，蒸餾水定容至1 L，pH 6.2，115℃高壓滅菌20min。

1.3 試驗方法

1.3.1 泡菜的制作工藝

1.3.2 添加不同比例馬奶酒樣乳桿菌ZW3發酵實驗

分別選取馬奶酒樣乳桿菌ZW3、植物乳桿菌299、乳酸菌723的比例為2∶1∶1、1∶1∶1、1∶2∶1、1∶1∶2、0∶1∶1，即馬奶酒樣乳桿菌ZW3占發酵劑的比例分別1/2、1/3、1/ 4、1/4、0，按上述工藝進行發酵，同時以自然發酵作為對照。測定發酵酸豆角的pH、總酸，并對其進行感官評分。每組試驗3組平行，試驗結果為3組平行的平均值。

1.3.3 加入馬奶酒樣乳桿菌ZW 3的酸豆角與自然發酵酸豆角風味物質對比分析試驗

根據1.3.2的試驗結果，選取最佳菌種比實驗組，對此實驗組與達到相同酸度的自然發酵組的風味物質進行測定。

1.3.4 檢測指標

1.3.4.1 pH及總酸的測定

使用pH計測定酸豆角發酵液的pH值；總酸的測定根據GB/T12356-2008中的規定，采用滴定法，以乳酸計。

1.3.4.2 感官評分

感官評分主要從樣品的色澤、香氣、質地與味道進行評分，感官指標要求及感官評分權重如表1所示。

表1 感官指標要求及感官評分權重[7]Table1 Indicators requirementsand evaluation criteria of the sensory

1.3.4 有機酸分析[8]

有機酸采用高效液相色譜（HPLC）進行測定與分析。

A．樣品的預處理

酸豆角汁加入0.1%（w/v）的磷酸中，4℃條件下9 000 rpm離心10min，取上清過0.45μm濾膜，備用。

B．色譜條件

液相色譜儀：島津L710A，色譜柱：VenusilMPC18（5μm，250×4.6mm），柱溫25℃，使用0.1%（w/v）的磷酸作為流動相，流速為1.0mL/min，紫外檢測波長210 nm，進樣量10μL。

C．標準曲線的制作及樣品的測定

準確稱取有機酸標準品草酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、丙酸，溶解于0.1%（w/v）的磷酸溶液中。分別以不同濃度進樣檢測，測定不同標準品的出峰時間及其不同濃度對應的峰面積，制作標準曲線。

將預處理后的樣品分別進行上機檢測，采用外標法計算樣品中有機酸的含量。

1.3.4 揮發性風味成分分析

使用固相微萃取（SPME）聯合氣相色譜/質譜（GC-MS）測定酸豆角中揮發性風味物質。

A.固相微萃取（SPME）樣品制備

取酸豆角發酵液2mL，放入5mL的萃取瓶中，擰緊瓶蓋。將手動固相微萃取器的萃取頭插入到樣品瓶蓋中，推出纖維頭，60℃吸附30min。隨后抽回纖維頭，拔出萃取頭，再將萃取頭插入氣相色譜儀推出纖維頭，在進樣口解吸附15min，進行GC-MS檢測分析。

B.分析條件

氣相色譜條件：色譜柱為VF-5MS30m×0.25mm× 0.25μm彈性毛細管柱；載氣He氣；載氣流量1mL/ min；進樣口溫度250℃；分流比5：1；升溫程序為40℃保持3min，5℃/min線性升溫至150℃，10℃/min線性升溫至250℃，然后于250℃保持5min。

質譜條件：離子源為EI源，離子阱溫度220℃，傳輸線溫度280℃；掃描范圍50 amu～1 000 amu；電離電壓為70 eV；溶劑延遲4min；譜庫NIST 05。

（5）亞硝酸鹽檢測

根據GB5009.33-2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽測定》中鹽酸萘乙二胺法對亞硝酸鹽進行測定[9]。

2 結果與分析

2.1 添加不同比例馬奶酒樣乳桿菌ZW 3發酵實驗

pH和總酸含量是泡菜成熟與否的標志，發酵過程中酸度值的變化是反映發酵過程的數量指標，因此，結合品嘗鑒定，測定酸度值可以了解發酵進程并確定產品的形成。在實驗條件為：接種量8%（體積分數），鹽濃度4%（w/v），糖濃度2%（w/v），室溫發酵7 d后，檢測發酵蔬菜的酸度。由圖1可知，接種發酵組的pH均低于3.305，酸度均大于1.3%；在實驗組中，添加馬奶酒樣乳桿菌ZW3的比例不一樣，pH和酸度也不一樣。隨著馬奶酒樣乳桿菌ZW 3所占比例的增多，樣品的pH隨著降低，酸度隨著增加。馬奶酒樣乳桿菌ZW3占發酵劑的比例為1/4的2組實驗，pH和酸度差別不明顯，并未因為乳酸菌723所占比例的增多而過多的改變；而另外2組隨著馬奶酒樣乳桿菌所占比例的增多，pH和酸度變化明顯，當占發酵劑的比例為1/2時，pH可達到3.215，酸度達到1.498%。即馬奶酒樣乳桿菌ZW 3的添加利于酸豆角酸味的形成。

根據感官評分可以得出，馬奶酒樣乳桿菌ZW3所占發酵劑的比例為1/3時的感官評分是所有酸豆角中評分最高的；而自然發酵酸豆角的評分不高，可能是由于自然發酵還沒有完全成熟，酸度不夠。

圖1 不同菌種比例對pH及總酸的影響Fig.1 Effectsof strainsproportion on pH valuesand totalacids contentsof pickle

表2 感官評分Table2 Thescoreof sensory evaluation

由于馬奶酒樣乳桿菌ZW3占發酵劑的比例為1/ 3時的實驗組發酵完成后能達到一個良好的效果，產品色香味達到最佳，pH及酸度都可以達到一個非常好的程度，而且風味口感均很好。所以選取馬奶酒樣乳桿菌ZW3占發酵劑的比例為1/3的實驗組作為最佳接種發酵組，與自然發酵進行風味物質的對比分析。

2.2 加入馬奶酒樣乳桿菌ZW3的酸豆角與自然發酵酸豆角風味物質對比分析試驗

泡菜的品質主要是由風味物質決定的，風味物質主要包括有機酸、揮發性的風味物等。這些風味物質也是自然發酵泡菜優于人工接種發酵泡菜的原因[4]。所以實驗將人工接種泡菜的風味與自然發酵泡菜的風味進行對比分析，以判斷人工接種泡菜的品質，也為指導人工接種泡菜提供科學基礎。

實驗在前期發酵基礎之上，將自然發酵的酸豆角繼續發酵，直至發酵成熟，酸度與pH與所選最佳接種發酵組的酸度一致時停止發酵，對2組樣品進行有機酸及揮發性風味物質的分析。

2.2.1 有機酸分析

根據標準品的保留時間與含量標準曲線，測得接種發酵酸豆角和自然發酵酸豆角中各有機酸的含量見表3。

泡菜酸味的主要來源是發酵過程中產生的有機酸。有機酸的存在不僅會改善食品的風味，使泡菜具有酸爽的口感，還能改變和加強其他風味物質所產生的味感。發酵后的泡菜主要含有的有機酸有：乳酸，甲酸，草酸，丙酸，琥珀酸，乙酸，蘋果酸，檸檬酸，富馬酸等。不同的有機酸所帶來的風味也不同。乳酸的酸味柔和，有后酸味，可提供柔和的風味；琥珀酸兼有海扇和豆醬類的風味，有研究表明，琥珀酸鈉含量為0.114%時就足夠呈現出一定程度的鮮味；乙酸有較強的刺激味，有強化食欲的功能；蘋果酸具有令人愉快的酸味，其酸味的產生和消失都比檸檬酸緩慢；富馬酸具有水果酸味；檸檬酸有令人愉快、清涼的酸味，但味覺消失迅速[10]。

表3 有機酸分析結果Table3 Organic acidscontentsof sample

通過2種發酵方式有機酸種類對比發現，2樣品有機酸的種類并無差異，說明人工接種發酵與自然發酵在有機酸的組成上是一致的。從有機酸的含量上看，草酸、甲酸、富馬酸含量差別不大，乳酸及琥珀酸的含量接種發酵高于自然發酵；蘋果酸、乙酸、檸檬酸及丙酸含量接種發酵低于自然發酵。分析原因可能是因為人工接種發酵在發酵過程中優勢菌種固定，而自然發酵中發酵菌種復雜，這種微生物菌群及生物量上的差異性引起了成熟后的泡菜中有機酸含量的差異。乳酸菌發酵產生的乳酸是泡菜酸味的關鍵成分，加入馬奶酒樣乳桿菌ZW3的發酵酸豆角乳酸含量明顯高于自然發酵，這也有可能是馬奶酒樣乳桿菌ZW3促進發酵產酸，加速泡菜成熟速度的原因。

2.2.2 揮發性風味物質分析

每一種蔬菜腌制品都有其特征風味物質，且這些特征風味物質揮發性較強[11]。酸菜有其自身的特征香氣，酯類、雜環類及其他含氧化合物都對香氣有一定貢獻[12]。這些香氣也可以減少泡菜原料中帶有的不良氣味。

圖2（a）（b）分別為人工接種發酵與自然發酵酸豆角的總離子流色譜圖。從接種發酵和自然發酵泡菜的總離子流色譜圖可以看出：發酵完成后，達到相同的酸度的情況下，接種發酵泡菜與自然發酵泡菜的揮發性風味物質峰形基本一致，含量上沒有太大的變化。

通過GC-MS自帶數據分析軟件及查詢化合物CAS號分析，接種發酵泡菜與自然發酵泡菜共有34種揮發性風味物質檢出。主要為酯類、醛類、酮類、醇類及烷烴類、酚類、烯烴類化合物。其中以醇類和酯類組分居多，分別鑒定出14個醇類組分，8個酯類組分。除此之外還有4個烯烴類組分，4個酮類組分以及2個醛類和2個酚類組分。

圖2 接種發酵（a）和自然發酵（b）酸豆角的總離子流色譜圖Fig.2 The total chroMatograMof inoculation ferMented（a）and natural ferMented（b）cowpe

揮發性風味物質檢測結果表明，接種發酵酸豆角中含有幾乎全部自然發酵酸豆角中的特征風味物質，且含量相差不大。所以在工業化大規模生產時，可以考慮使用實驗組所選用的菌種作為人工接種的發酵劑。

2.2.3 亞硝酸鹽的測定

對兩組樣品進行亞硝酸鹽含量的測定，接種發酵的樣品亞硝酸鹽的含量為0.150mg/kg，自然發酵樣品的亞硝酸鹽的含量為1.622mg/kg，均符合國家標準GB5009.33-2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽測定》中規定的泡菜的亞硝酸鹽含量不應該超過20mg/kg的標準。并且人工接種樣品的亞硝酸鹽含量低于自然發酵的樣品。

3 結論

綜上所述，馬奶酒樣乳桿菌ZW3可與其他乳酸菌復配用于酸豆角的發酵。在相同接種量的情況下，隨著馬奶酒樣乳桿菌所占比例的增大，發酵過程中產酸速度加快，發酵時間縮短；并且在發酵成熟后，所含有的風味物質在種類與含量上與自然發酵基本一致，可以可作為一種新型蔬菜發酵菌種使用。這一實驗結果為發酵蔬菜菌種的開發，加速發酵蔬菜安全及工業化生產奠定了基礎。

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App lication of Lactobacillus Kefiranofaciens ZW 3 in Cowpea FerMentation

ZHENGYong-na1，ZHAOYong2，WANG Jing-rui1，WANGYan-ping1，*
（1.Key Laboratoryof Food Nutrition and Safety，Collegeof Food Engineering&Biotechnology，Tianjin University ofScience&Technology，Tianjin 300457，China；2.Community Health Service Centre，Nanshi Street，Heping District，Tianjin 300457，China）

Lactobacillus kefiranofaciens ZW3mixed with Lactobacillus plantaruM299 and Lactic acid bacteria 723 in different proportion for acid fermented cowpea was studied.Under the certain innoculums，fermented cowpea pH was decreased and acidity was increased with the increase of the proportion of Lactobacillus kefiranofaciens ZW3.According to the results of sensory score，fermented cowpea tasted bestwhen the three kindsofbacteriaweremixed with a ratio of1∶1∶1.Through the analysisof the organic acidsand volatile flavor compounds，the types and quantities of organic acids and volatile flavor compounds was consistent between inoculated fermentation of the bestproportion and natural fermentation.Lactobacillus kefiranofaciens ZW3 was used in fermented vegetablesand the productshavegood acid productivity，rapid lowered pH，and good taste.

Lactobacilluskefiranofaciens ZW 3；sour cowpea；acid production；flavor compounds

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.18.097

2014-09-24

“十二五”科技部高技術發展研究計劃‘863計劃’：果蔬發酵食品，調味品及微生物油脂生產關鍵技術（2011AA100904）

鄭永娜（1989—），女（漢），在讀碩士，研究方向：食品生物技術。

*通信作者：王艷萍（1962—），女（漢），教授，博士，研究方向：食品生物技術。