農藥與DNA相互作用的光譜法分析

2014-03-22 10:27:16許杭杰李婧張全周聰陸美婭葉景甲

湖北農業科學 2014年1期

許杭杰+李婧+張全+周聰+陸美婭+葉景甲

摘要：綜述了光譜方法在農藥與DNA相互作用研究中的應用，重點介紹了紫外光譜法、熒光光譜法、圓二色光譜法、紅外光譜法、共振光散射和拉曼光譜法等的原理和應用。光譜法不但是研究農藥與DNA相互作用的有效工具，同時也可以加強對農藥的遺傳毒性分子機理的理解。

關鍵詞：光譜法；農藥；DNA；相互作用

中圖分類號：TQ450.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）01-0005-03

Spectroscopic Analyses on the Interaction of Pesticides and DNA

XU Hang-jie，LI Jing，ZHANG Quan，ZHOU Cong，LU Mei-ya，YE Jing-jia

（Environmental Science Research Center， Zhejiang University of Technology， Hangzhou 310032， China）

Abstract： Analyzing the interaction of DNA and pesticides with spectrometry including ultraviolet-visible absorption spectroscopy， fluorescent spectroscopy， circular dichroism spectroscopy， infrared spectroscopy， resonance light scattering spectroscopy and Raman spectroscopy was reviewed. Results showed that spectroscopy was highly effective and powerful for studing the interaction of DNA and pesticides， and would promote understanding molecular mechanisms of the genotoxicity of pesticides.

Key words： spectroscopy； pesticide； DNA； interaction

收稿日期：2013-06-25

基金項目：中國博士后科學基金面上項目（2012M521180）

作者簡介：許杭杰（1989-），男，浙江杭州人，在讀碩士研究生，研究方向為農藥與DNA的相互作用，（電話）0571-88320265（電子信箱）

xuhj-tobe-ceo@163.com；通訊作者，張全，博士，（電子信箱）quanzhang@zju.edu.cn。

農藥是一類由人類主動投放到環境當中用來防治農作物病蟲草害和其他有害生物的藥劑的統稱。隨著社會的發展和農業集約化要求的不斷加強，對農藥的需求也在不斷增加，在今后相當長的時間內農藥的作用是不可替代的。然而大量的事實證明，農藥的廣泛使用已經成為環境污染的重要原因之一。DNA是生物體的重要組成部分，是生物遺傳信息的主要載體。農藥能通過飲食、呼吸、皮膚接觸等途徑進入機體，可能與DNA相互作用后不同程度地導致DNA的結構及其功能的變化，對生物體產生持久性危害[1-4]，進而引發潛在的生態安全和健康風險。因此，關于農藥與DNA之間相互作用而導致遺傳物質誘變已成為當今研究的熱點[5]。

農藥與DNA的作用方式主要有三種：非共價鍵結合、共價鍵結合和剪切作用。其中非共價鍵結合又可分為靜電結合、溝槽結合和嵌插結合[6]。農藥與DNA作用后可能導致DNA構象變化、鏈聚合或斷裂、堿基脫落、堿基被修飾、交聯、重組等[7-9]，亦即體系的結構和化學性質會發生一定變化（圖1）。人們采用多種方法（生物學方法、光譜法、電化學法和色譜法等）從不同角度探索這些變化，進而判斷作用方式和闡述作用機理[10]。本文綜述了常用于研究農藥與DNA相互作用的光譜方法原理和應用。

1 紫外可見光譜法

紫外可見光譜法是研究農藥與DNA相互作用的一種最方便、最常用的技術[11]。小分子與DNA的相互作用會引起吸收帶的紅移（藍移）現象或增色（減色）效應。增色效應是DNA雙螺旋結構被破壞的結果，減色效應則是DNA分子軸向收縮、構象變化的結果。吸光度減小、吸收帶紅移以及等吸收點的形成是小分子與生物DNA發生嵌插作用的光譜標志[12]。嵌插作用對DNA的雙螺旋結構起穩定作用，可導致熔鏈溫度Tm值增大5～8 ℃，而非嵌插作用的小分子不會使Tm值增大得如此明顯。邵華等[11]已采用紫外光譜法研究農藥的DNA加合作用，結果表明馬拉硫磷、呋喃丹、氯氰菊酯及兩兩混配后均可能與哺乳動物DNA結合，引起DNA的紫外譜圖發生明顯的波長位移，甚至產生新的波峰[12]。Farhad等[13]也利用紫外和熒光光譜法發現二嗪農能使小牛胸腺DNA（Calf thymus DNA，ct DNA）光譜產生藍移。此外，劉偉等[14]研究了農藥毒死蜱對小牛胸腺DNA和蠶豆根尖細胞的損傷作用。結果表明，它使得小牛胸腺DNA吸收光譜在207 nm處的吸收峰出現紅移現象，隨著藥劑濃度的增加，譜圖出現了減色效應。

2 熒光光譜法

熒光光譜法作為一種快速、靈敏的光譜分析方法也廣泛用于農藥與DNA相互作用的研究。通過對熒光參數（如熒光偏振、熒光強度等）的測定，可獲得許多關于農藥與DNA相互作用的信息。農藥與DNA作用后熒光偏振的變化是判斷農藥是否與DNA發生嵌插作用的標志之一。借助熒光強度的變化，可測得農藥與DNA的結合常數、結合位點數和作用方式等。

對于熒光很弱的農藥，可借助熒光探針進行研究。溴化乙錠（Ethidium bromide，EB）是較為常用的一類探測農藥與DNA相互作用的熒光探針，利用EB-DNA體系的熒光變化，可判定農藥與DNA的作用方式。孟慶翔等[15]選用溴化乙錠（EB）為熒光探針，考察了阿特拉津濃度、磷酸鹽、離子強度以及碘化鉀對系統熒光的影響。結果表明，阿特拉津對ctDNA-EB體系的熒光存在淬滅現象，并同時存在靜態和動態兩種淬滅方式。張立金等[16]對農藥甲萘威（Carbaryl）對ct DNA的損傷作用也進行了初步的探討，證明甲萘威的確對DNA具有一定的損傷作用，而這種損傷可能和甲萘威與DNA的相互作用有關。

3 圓二色光譜法

圓二色光譜（Circular dichroism，CD）是測定樣品對左、右旋偏振光的吸光度差。樣品是否有圓二色性取決于樣品的發色團是否具有手性。一般可通過農藥對DNA的圓二色信號的改變判斷DNA構象的變化，如果DNA在280 nm附近圓二色信號無變化，可排除農藥與DNA作用方式是嵌插作用。Soheila等[17]對二嗪農對DNA的CD光譜進行了研究，結果在280 nm處發現峰形未發生變化，表明二嗪農與DNA的作用是非嵌插作用。Farhad等[18]用CD證明了有機氯殺蟲劑2，4-D與DNA亦可發生作用。

4 紅外光譜法

當紅外光照射時，物質的分子將吸收紅外輻射，引起分子的振動和轉動能級間的躍遷，所產生的分子吸收光譜成為紅外吸收光譜。近年來，傅里葉變換紅外光譜法在小分子與DNA相互作用的研究中得到了廣泛應用。文獻[19]報道了致癌物質Diethylstilbestrol（DES）與ct DNA之間的作用模式、結合常數、序列選擇性以及DNA結構和構象的變化情況。當DES濃度較低時，A·T富集區是DES與DNA發生嵌插作用的主要位點，伴隨著這種嵌插結合過程，DNA逐漸由B型向A型轉變；當DES藥物濃度較高時，DES與G·C堿基發生作用，并削弱了DNA雙螺旋結構的穩定性。Zhou等[20]通過紅外等光譜手段研究了聚二烯丙基二甲基氯化銨（PDDA）與DNA之間的作用方式。紅外光譜研究結果表明，PDDA與DNA分子中的堿基和磷酸基團發生了作用，且DNA/PDDA復合物的形成導致DNA二級結構構象發生了變化。

5 共振光散射和拉曼光譜法

共振光散射技術一般檢測物體的共振瑞利光信號。利用農藥誘導DNA共振光信號的變化可探測DNA的構象變化、聚集和超螺旋結構的形成，進而推斷農藥與DNA的作用方式[21，22]。拉曼光譜屬于振動光譜，共振拉曼效應極大提高了拉曼光譜的靈敏度。拉曼光譜法對農藥與DNA的分析主要研究其構象的變化、堿基的損傷、氫鍵的斷裂和單雙鏈的斷裂等。周殿鳳等[23]的研究結果表明，ct DNA在253.7 nm處受到紫外輻射的損傷作用最嚴重，DNA的構象受到破壞，DNA的構型發生變化，部分單雙鍵發生斷裂，出現了各種各樣由于DNA鍵斷裂產生的多核苷酸。Wen等[24]運用拉曼光譜對病毒DNA在不同波段處的吸收進行了研究。

綜上所述，光譜方法在農藥與DNA相互作用的研究中應用十分廣泛，不同的光譜法互相驗證可提供更準確的信息。紫外方法檢測紫外吸收的差別有簡單、準確的特點，但紫外可見光譜反映的信息量有限；熒光光譜有多種熒光參數可利用，能推斷農藥與DNA的結合常數、結合位點數和作用方式等；而且紫外方法和熒光方法又常受限于一些物質，如紫外吸收信號或熒光信號弱，又或與DNA光譜重疊等問題。圓二色譜、紅外色譜、共振光散射和拉曼光譜法都是檢測DNA結構變化的有效方法，圓二色譜對手性分子的檢測具有一定的優勢，有可能在手性農藥與DNA相互作用的研究中發揮更大的作用。紅外光譜由于受水的紅外吸收的影響而限制了其在水溶液體系中的應用。因此，研究農藥與DNA的相互作用常要求結合多種光譜方法互相驗證。

6 展望

目前，關于農藥與DNA相互作用的研究主要集中在少數幾種農藥上，且基本上使用紫外光譜法、熒光光譜法和彗星實驗這三種方法來評價農藥對DNA的損傷作用。如果再結合其他的分析技術如電化學方法等從不同角度進行多方位、多層次的研究，對農藥與DNA作用的方式和機理的了解會更加深入。此外，隨著手性農藥在目前使用的農藥中所占比例越來越大，以及它們在生物體上表現出的潛在生物效應如毒性、致癌性、致突變性等對映體的選擇性[25]，建立一種能夠準確可靠的研究手性農藥對映體水平上遺傳毒性的差異的快速評價方法將顯得尤為重要，因此開展手性農藥與DNA相互作用研究的光譜法研究是一個重要的領域，能為手性農藥的環境安全性評價提供更為寶貴的科學依據。

參考文獻：

[1] RODRIGUES G S，PIMENTEL D，WEINSTEIN L H. In situ assessment of pesticide genotoxicity in an integrated pest management program I-Tradescantia micronucleus assay[J]. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis，1998，412（3）：225-224.

[2] SHAHIN S， EBRAHIM A， ROHOLLAH H， et al. Evaluation of oxidative stress and genotoxicity in organophosphorus insecticide formulators[J]. Human & Experimental Toxicology，2005， 24（9）：439-445.

[3] RAMBABU N， KAISER J. Determination of AChE levels and genotoxic effects in farmers occupationally exposed to pesticides[J]. Human & Experimental Toxicology，2007，26（9）：723-731.

[4] RANJITA B， TODD B S， GILLIAN M， et al. Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinsons disease[J]. Nature Neuroscience，2000，3（12）：1301-1306.

[5] UNDEGER U， BASARAN N. Effects of pesticides on human peripheral lymphocytes in vitro： Induction of DNA damage[J]. Archives of Toxicology，2005，79（3）：169-176.

[6] KUMAR C V， EMMA H A. DNA binding studies and site selective fluorescence sensitization of an anthryl probe[J]. Journal of America Chemistry Society，1993，115（19）：8547-8553.

[7] GABRIELLA C， ELISABETTA P， ALMA B， et al. DNA damage and apoptosis induction by the pesticide Mancozeb in rat cells： Involvement of the oxidative mechanism[J]. Toxicology & Applied Pharmacology，2006，211（2）：87-96.

[8] ELSA S A， MARIA D J， ELAZABETH R G， et al. Sperm chromatin alteration and DNA damage by methyl-parathion， chlorpyrifos and diazinon and their oxon metabolites in human spermatozoa[J]. Reproductive Toxicology，2008，25（4）：455-460.

[9] KRISHNAMURTHI K，SARAVANA D，CHAKRABARTI T. DNA damage caused by pesticide-contaminated soil[J]. Biomedical and Environmental Sciences，2006，19（6）：427-431.

[10] CHUN Y Q， SHU Y B， YING S， et al. Study of interactions of anthraquinones with DNA using ethidium bromide as a fluorescence probe[J]. Spectrochimica Acta Part A，2008，70（1）：136-143.

[11] 邵華，師以康.紫外光譜法測定混配農藥的DNA加合作用[J].中國公共衛生，2003，19（1）：81-82.

[12] LONG E C， BARTON J K. On demonstrating DNA intercalation[J]. Acc Chem Res，1990，23（9）：271-273.

[13] FARHAD A， SOHEILA K， MOHAMMAD B G. Interaction of Diazinon with DNA[J]. Toxicology Letters，2007，172：5205.

[14] 劉偉，朱魯生，王軍，等.利用吸收光譜法和微核法測定3種農藥對DNA損傷的作用[J].農業環境科學學報，2006，25（2）：531-534.

[15] 孟慶翔，任麗萍，張濤，等. 熒光探針技術研究阿特拉津與ct DNA的相互作用[J]. 光譜學與光譜分析，2008，28（9）：2122-2125.

[16] 張立金，閔順耕，孫英，等.農藥甲萘威對DNA損傷作用的初探[A]. 農藥與環境安全國際會議論文集[C].北京：中國農業大學出版社，2003.

[17] SOHEILA K， MOHAMMAD B G， FARHAD A， et al. Interaction of diazinon with DNA and the protective role of selenium in DNA damage[J]. DNA and Cell Biology，2008，27（6）：325-332.

[18] FARHAD A， FATEMETH B. In vitro study of damaging effects of 2， 4-Dichlorophenoxyacetic acid on DNA structure by spectroscopic and voltammetric techniques[J]. DNA and Cell Biology， 2009，28（10）：527-533.

[19] NEAULT J F， TAJMIR-RIAHI H A. Diethylstilbestrol-DNA interaction studied by Fourier transform infrared and Raman spectroscopy[J]. Journal of Biological Chemistry，1996，271（14）：8140-8143.

[20] ZHOU Y L， LI Y Z. Studies of the interaction between poly （diallyldimethyl ammonium chloride） and DNA by spectroscopic methods[J]. Colloid Surface A，2004，233（1-3）：129-135.

[21] 杜鳳沛，劉剛，羅小林，等.以光散射技術研究啶蟲脒的測定及其與DNA的相互作用[J].光譜學與光譜分析，2008，28（6）：1368-1371.

[22] 任麗萍，江樹人，饒震紅.阿特拉津與DNA作用共振光散射光譜的研究及其應用[J].分析測試學報，2004，23（6）：57-60.

[23] 周殿鳳，柯惟中.紫外輻射對小牛胸腺DNA水溶液影響的拉曼光譜研究[J].光譜與光譜學分析，2005，24（11）：1370-1372.

[24] WEN A Q， THOMAS G J. Demonstration by ultraviolet resonance Raman spectroscopy of differences in DNA organization and interactions in filamentous viruses Pf1 and fd [J]. Biochemistry， 1999，38（10）：3148-3156.

[25] 劉維屏.農藥環境化學[M].北京：化學工業出版社，2005.1-11.

（責任編輯王貴春）