單菌落PCR在發夾RNA重組克隆鑒定中的應用

李旭艷+惲冬澤+邵淑麗

摘要：以單菌落為模板進行PCR擴增，直接篩選插有發夾RNA（Small hairpin RNA，shRNA）干擾片段的重組陽性克隆。以圓滑單菌落為PCR模板，采用載體通用引物直接擴增目的片段，質粒測序驗證 PCR結果的正確性。結果表明，在篩選的6個菌落中均擴增出324 bp的目的條帶，進一步進行測序分析鑒定，證實了菌落PCR陽性克隆含有發夾RNA干擾片段。單菌落PCR是一種簡便、快速、可靠、有效篩選重組陽性克隆的方法。

關鍵詞：單菌落PCR；重組克隆；發夾RNA

中圖分類號：Q781；S961.6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）01-0220-02

Application of Individual Bacterial Colonies PCR in Screening

shRNA Recombinant Clone

LI Xu-yan，YUN Dong-ze，SHAO Shu-li

（College of Life Science and Agro-forestry， Qiqihar University， Qiqihar 161006， Heilongjiang， China）

Abstract： The individual bacterial colonies were adopted for templates of PCR to screen recombinant clone carrying small hairpin RNA. The PCR amplification with individual bacterial colonies and universal primer was developed to detect targeting fragment. The positive colonies were further confirmed by sequencing. Results showed that among the six clones， the positive band in the size of 324 bp were detected on agarose gel. DNA sequencing confirmed that shRNA template was cloned into plasmid vector successfully. Individual bacterial colony PCR is a simple，rapid，reliable and efficient method for screening the recombinant clones.

Key words： individual bacterial colonies PCR；recombinant clone；shRNA

收稿日期：2013-05-10

基金項目：黑龍江省自然科學基金項目（C200624）；黑龍江省教育廳科學技術項目（11511447；12511611）

作者簡介：李旭艷（1982-），女，山東濟南人，講師，主要從事遺傳學方面的研究，（電話）0452-2782835（電子信箱）lxy0702@126.com；

通訊作者，邵淑麗，教授，主要從事分子生物學方面的研究，（電話）0452-2738219（電子信箱）shshl132@163.com。

在基因重組試驗中，篩選含有插入目的基因片段的重組陽性克隆常用的方法有快提質粒、酶切法、互補插入失活法及雜交篩選法等[1]，這些方法各有其優缺點。

近年來，由于聚合酶鏈反應技術（Polymerase chain reaction，PCR）具有簡便、快速及靈敏等特點，研究者建立了PCR鑒定陽性克隆的方法，通常以提取的質粒或者裂解的菌液作為PCR的模板[2，3]，可以獲得良好的篩選效率。為進一步簡化制備模板的步驟，節約時間，本試驗以單個轉化菌體為模板，不經過任何處理，采用載體通用引物直接擴增目的片段，來初步鑒定和篩選陽性轉化菌，為該方法的使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

T4 DNA ligase、BamHⅠ、HindⅢ購自TOYOBO公司，E. coli DH5α、氨芐青霉素（Amp）、PCR試劑盒、pSilencer 3.1-h1 neo（AmpR）載體由鼎國生物技術有限公司提供。

shRNA模板為F，5′-GATCCGAAGGAAAAGAA

ACCAACTTTCAAGAGAAGTTGGTTTCTTTTCCTTCT

TTTTTGGAAA-3′；R，5′-AGCTTTTCCAAAAAAGAA

GGAAAAGAAACCAACTTCTCTTGAAAGTTGGTTTC

TTTTCCTTCG-3′，由北京奧科生物技術有限公司合成，退火為雙鏈。PCR引物為F，5′-GTTTTCCCAGT

CACGAC-3′；R，5′-GAGTTAGCTCACTCATTAGGC-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 PCR模板的制備 采用BamHⅠ、HindⅢ雙酶切pSilencer 3.1-h1 neo載體質粒，與退火的帶有相同酶切位點的shRNA模板4 ℃連接過夜，連接產物轉化E. coli DH5α感受態細胞，涂布于含氨芐青霉素（50 μg/mL）的LB固體培養基上，37 ℃培養12～16 h。

1.2.2 單菌落PCR擴增 制備除模板DNA和Taq酶外的PCR反應體系： 10×Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL， ddH2O 20.5 μL，上下游引物各0.5 μL，隨后用滅菌牙簽挑取圓滑單菌落，在預先分格并標記數字的另一LB平皿上點板，然后點入相應PCR反應體系，完成模板接種，快速加Taq酶，用手指輕彈管壁，瞬時離心，立即開始擴增。設陰性對照，加入除了模板以外的所有PCR 反應試劑；以pSilencer 3.1-h1 neo空載體質粒為陽性對照。PCR 反應條件為：94 ℃預變性2 min；94 ℃ 變性30 s， 55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，共35個循環；72 ℃ 延伸1 min，4 ℃保存。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，判斷擴增出目的片段是否為真陽性轉化子。點板的平皿37 ℃培養12～16 h。

1.2.3 質粒測序 PCR產物鑒定為陽性克隆的與平皿上的編號進行核對，挑取平皿上的陽性克隆少許，接種于2 mL含氨芐青霉素的培養基中，37 ℃ 180 r/min 過夜培養。小提陽性克隆質粒及陽性對照質粒，采用反向引物測序，由鼎國生物技術有限公司完成。

2 結果與分析

2.1 單菌落PCR篩選陽性克隆

以挑取的單菌落為模板進行PCR擴增，經電泳分析，在篩選的6個菌落中均可擴增出324 bp大小的陽性條帶（圖1），與預期基因片斷大小一致，因此推測這6個克隆可能為含有發夾RNA干擾片段的陽性克隆。

2.2 陽性克隆質粒的測序鑒定

為了進一步驗證菌落PCR結果的正確性，將陽性對照及隨機挑選的PCR陽性克隆進行質粒提取、測序分析。測序結果證明（圖2、圖3），菌落PCR陽性克隆含有正向插入的shRNA基因序列。

3 討論

常規 PCR技術是目前分子生物學技術中一種常用的鑒定方法，PCR擴增的結果準確、可靠，但常規PCR的模板制備與純化操作繁瑣，成本較高，而且制備的DNA易攜帶抑制PCR擴增的試劑[4]。研究者在此基礎上進行了改進，Gussow等[5]用無菌牙簽挑取單個菌落到TE緩沖液中，煮沸5 min，漩渦振蕩后短暫離心，用1～2 μL裂解液作為DNA模板，篩選出陽性克隆；Sathe等[6]將含有重組質粒的細菌經過94 ℃變性1 min處理后，用倒置顯微鏡觀察發現，大部分細菌破裂釋放出了DNA。因此，可將細菌直接作為PCR反應的模板，而不需要抽提、純化質粒DNA，同時又避免在抽提過程中DNA的損失。

本試驗沒有采用α互補及酶切法鑒定重組克隆，是因為試驗中所選用的質粒不含lacI基因，插入的片段只有66 bp，與載體的分子量大小差別較大，且酶切下來的短片段在電泳凝膠中的顯示受質粒溶液中殘留RNA的干擾，亮度極弱，不能清楚顯示[7]。因此，采用單菌落PCR方法排除連接轉化試驗中出現的大量假陽性菌落，避免了測序后才發現問題將會帶來的時間和成本的浪費。PCR選用pSilencer 3.1-h1 neo空載體質粒為陽性對照，載體多克隆位點序列為61 bp，與shRNA序列相差2 bp，瓊脂糖電泳不能檢測到這樣小的差異。通過對陽性對照質粒及菌落PCR鑒定為陽性的克隆測序，結果驗證了菌落PCR的正確性。應用單菌落 PCR擴增可同時鑒定分析很多菌落，不需要貯藏大量候選克隆。與常規菌落PCR相比，簡化了模板處理的步驟，同樣能夠準確有效地篩選出陽性克隆。因此，單菌落 PCR是一種簡便、快速、有效的重組克隆篩選的方法。

參考文獻：

[1] 薩姆布魯克.分子克隆實驗指南[M].北京：科學出版社，2002.

[2] 薛國柱，竇科峰，呂勇剛，等.兩種菌落聚合酶鏈反應在抗體庫篩選中的應用比較[J].醫學研究生學報，2004，17（12）：1057-1061.

[3] 沈關心，朱慧芬，張 悅，等.菌落PCR和質粒PCR對轉化菌的篩選[J].免疫學雜志， 2000，16（2）：149-151.

[4] 陳書霞，王曉武，房玉林.單菌落PCR法直接快速鑒定重組克隆[J].微生物學通報，2006，33（3）：52-56.

[5] GUSSOW D， CLACKSON T. Direct clone characterization from plaques and colonies by the polymerase chain reaction[J].Nucleic Acids Research， 1989， 17（10）： 4000.

[6] SATHE G M，O'BRIEN S， MCLAUGHIN M M， et al. Use of polymerase chain reaction for rapid detection of gene insertions in whole yeast cells[J]. Nucleic Acids Research，1991，19（17）：4775.

[7] 李俊剛，陳耀凱，王宇明.自身引物菌落聚合酶鏈反應篩選 LoxP序列重組陽性克隆[J].中華檢驗醫學雜志，2004，27（8）：528.

（責任編輯 趙 娟）

1.2.3 質粒測序 PCR產物鑒定為陽性克隆的與平皿上的編號進行核對，挑取平皿上的陽性克隆少許，接種于2 mL含氨芐青霉素的培養基中，37 ℃ 180 r/min 過夜培養。小提陽性克隆質粒及陽性對照質粒，采用反向引物測序，由鼎國生物技術有限公司完成。

2 結果與分析

2.1 單菌落PCR篩選陽性克隆

以挑取的單菌落為模板進行PCR擴增，經電泳分析，在篩選的6個菌落中均可擴增出324 bp大小的陽性條帶（圖1），與預期基因片斷大小一致，因此推測這6個克隆可能為含有發夾RNA干擾片段的陽性克隆。

2.2 陽性克隆質粒的測序鑒定

為了進一步驗證菌落PCR結果的正確性，將陽性對照及隨機挑選的PCR陽性克隆進行質粒提取、測序分析。測序結果證明（圖2、圖3），菌落PCR陽性克隆含有正向插入的shRNA基因序列。

3 討論

常規 PCR技術是目前分子生物學技術中一種常用的鑒定方法，PCR擴增的結果準確、可靠，但常規PCR的模板制備與純化操作繁瑣，成本較高，而且制備的DNA易攜帶抑制PCR擴增的試劑[4]。研究者在此基礎上進行了改進，Gussow等[5]用無菌牙簽挑取單個菌落到TE緩沖液中，煮沸5 min，漩渦振蕩后短暫離心，用1～2 μL裂解液作為DNA模板，篩選出陽性克隆；Sathe等[6]將含有重組質粒的細菌經過94 ℃變性1 min處理后，用倒置顯微鏡觀察發現，大部分細菌破裂釋放出了DNA。因此，可將細菌直接作為PCR反應的模板，而不需要抽提、純化質粒DNA，同時又避免在抽提過程中DNA的損失。

本試驗沒有采用α互補及酶切法鑒定重組克隆，是因為試驗中所選用的質粒不含lacI基因，插入的片段只有66 bp，與載體的分子量大小差別較大，且酶切下來的短片段在電泳凝膠中的顯示受質粒溶液中殘留RNA的干擾，亮度極弱，不能清楚顯示[7]。因此，采用單菌落PCR方法排除連接轉化試驗中出現的大量假陽性菌落，避免了測序后才發現問題將會帶來的時間和成本的浪費。PCR選用pSilencer 3.1-h1 neo空載體質粒為陽性對照，載體多克隆位點序列為61 bp，與shRNA序列相差2 bp，瓊脂糖電泳不能檢測到這樣小的差異。通過對陽性對照質粒及菌落PCR鑒定為陽性的克隆測序，結果驗證了菌落PCR的正確性。應用單菌落 PCR擴增可同時鑒定分析很多菌落，不需要貯藏大量候選克隆。與常規菌落PCR相比，簡化了模板處理的步驟，同樣能夠準確有效地篩選出陽性克隆。因此，單菌落 PCR是一種簡便、快速、有效的重組克隆篩選的方法。

參考文獻：

[1] 薩姆布魯克.分子克隆實驗指南[M].北京：科學出版社，2002.

[2] 薛國柱，竇科峰，呂勇剛，等.兩種菌落聚合酶鏈反應在抗體庫篩選中的應用比較[J].醫學研究生學報，2004，17（12）：1057-1061.

[3] 沈關心，朱慧芬，張 悅，等.菌落PCR和質粒PCR對轉化菌的篩選[J].免疫學雜志， 2000，16（2）：149-151.

[4] 陳書霞，王曉武，房玉林.單菌落PCR法直接快速鑒定重組克隆[J].微生物學通報，2006，33（3）：52-56.

[5] GUSSOW D， CLACKSON T. Direct clone characterization from plaques and colonies by the polymerase chain reaction[J].Nucleic Acids Research， 1989， 17（10）： 4000.

[6] SATHE G M，O'BRIEN S， MCLAUGHIN M M， et al. Use of polymerase chain reaction for rapid detection of gene insertions in whole yeast cells[J]. Nucleic Acids Research，1991，19（17）：4775.

[7] 李俊剛，陳耀凱，王宇明.自身引物菌落聚合酶鏈反應篩選 LoxP序列重組陽性克隆[J].中華檢驗醫學雜志，2004，27（8）：528.

（責任編輯 趙 娟）

1.2.3 質粒測序 PCR產物鑒定為陽性克隆的與平皿上的編號進行核對，挑取平皿上的陽性克隆少許，接種于2 mL含氨芐青霉素的培養基中，37 ℃ 180 r/min 過夜培養。小提陽性克隆質粒及陽性對照質粒，采用反向引物測序，由鼎國生物技術有限公司完成。

2 結果與分析

2.1 單菌落PCR篩選陽性克隆

以挑取的單菌落為模板進行PCR擴增，經電泳分析，在篩選的6個菌落中均可擴增出324 bp大小的陽性條帶（圖1），與預期基因片斷大小一致，因此推測這6個克隆可能為含有發夾RNA干擾片段的陽性克隆。

2.2 陽性克隆質粒的測序鑒定

為了進一步驗證菌落PCR結果的正確性，將陽性對照及隨機挑選的PCR陽性克隆進行質粒提取、測序分析。測序結果證明（圖2、圖3），菌落PCR陽性克隆含有正向插入的shRNA基因序列。

3 討論

常規 PCR技術是目前分子生物學技術中一種常用的鑒定方法，PCR擴增的結果準確、可靠，但常規PCR的模板制備與純化操作繁瑣，成本較高，而且制備的DNA易攜帶抑制PCR擴增的試劑[4]。研究者在此基礎上進行了改進，Gussow等[5]用無菌牙簽挑取單個菌落到TE緩沖液中，煮沸5 min，漩渦振蕩后短暫離心，用1～2 μL裂解液作為DNA模板，篩選出陽性克隆；Sathe等[6]將含有重組質粒的細菌經過94 ℃變性1 min處理后，用倒置顯微鏡觀察發現，大部分細菌破裂釋放出了DNA。因此，可將細菌直接作為PCR反應的模板，而不需要抽提、純化質粒DNA，同時又避免在抽提過程中DNA的損失。

本試驗沒有采用α互補及酶切法鑒定重組克隆，是因為試驗中所選用的質粒不含lacI基因，插入的片段只有66 bp，與載體的分子量大小差別較大，且酶切下來的短片段在電泳凝膠中的顯示受質粒溶液中殘留RNA的干擾，亮度極弱，不能清楚顯示[7]。因此，采用單菌落PCR方法排除連接轉化試驗中出現的大量假陽性菌落，避免了測序后才發現問題將會帶來的時間和成本的浪費。PCR選用pSilencer 3.1-h1 neo空載體質粒為陽性對照，載體多克隆位點序列為61 bp，與shRNA序列相差2 bp，瓊脂糖電泳不能檢測到這樣小的差異。通過對陽性對照質粒及菌落PCR鑒定為陽性的克隆測序，結果驗證了菌落PCR的正確性。應用單菌落 PCR擴增可同時鑒定分析很多菌落，不需要貯藏大量候選克隆。與常規菌落PCR相比，簡化了模板處理的步驟，同樣能夠準確有效地篩選出陽性克隆。因此，單菌落 PCR是一種簡便、快速、有效的重組克隆篩選的方法。

參考文獻：

[1] 薩姆布魯克.分子克隆實驗指南[M].北京：科學出版社，2002.

[2] 薛國柱，竇科峰，呂勇剛，等.兩種菌落聚合酶鏈反應在抗體庫篩選中的應用比較[J].醫學研究生學報，2004，17（12）：1057-1061.

[3] 沈關心，朱慧芬，張 悅，等.菌落PCR和質粒PCR對轉化菌的篩選[J].免疫學雜志， 2000，16（2）：149-151.

[4] 陳書霞，王曉武，房玉林.單菌落PCR法直接快速鑒定重組克隆[J].微生物學通報，2006，33（3）：52-56.

[5] GUSSOW D， CLACKSON T. Direct clone characterization from plaques and colonies by the polymerase chain reaction[J].Nucleic Acids Research， 1989， 17（10）： 4000.

[6] SATHE G M，O'BRIEN S， MCLAUGHIN M M， et al. Use of polymerase chain reaction for rapid detection of gene insertions in whole yeast cells[J]. Nucleic Acids Research，1991，19（17）：4775.

[7] 李俊剛，陳耀凱，王宇明.自身引物菌落聚合酶鏈反應篩選 LoxP序列重組陽性克隆[J].中華檢驗醫學雜志，2004，27（8）：528.

（責任編輯 趙 娟）