土壤中微生物DNA高效提取方法的篩選

2014-03-22 19:11:50周偉黃進勇李新偉

湖北農業科學 2014年1期

周偉+黃進勇+李新偉

摘要：設計了3種從土壤中直接提取微生物DNA的方法，并通過PCR擴增和DGGE電泳比較了不同方法所提取DNA的質量以及對后期分子生物學研究的適用性。結果表明，化學法和酶法相結合的提取方法所獲得的DNA完整性最好，適用于PCR擴增，并且通過DGGE電泳分離出最豐富的條帶，是一種高效的提取土壤微生物DNA的方法。

關鍵詞：土壤微生物；DNA提取；PCR；DGGE

中圖分類號：Q939.96；Q523 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）01-0216-04

Screening the Extracting Method of Total Microbial DNA from Soil

ZHOU Wei1，HUANG Jin-yong2，LI Xin-wei1

（1. Luohe Medical College of Higher Education， Luohe 462002， Henan， China；

2. Bioengineering Department， Zhengzhou University， Zhenzhou 450001， China）

Abstract： Three methods were designed to extract microbial DNA directly from the soil， and the different extraction methods were evaluated comprehensively for the DNA quality and applicability of the molecular biology by PCR and DGGE. The results suggested that the combination of enzymatic and chemical methods could obtain the highest DNA yield and integrity， which was suitable for PCR， and the most abundant bands could be obtained by DGGE. This development of the highly effective DNA extraction method provided a foundation for studying in molecular ecology of soil microbes.

Key words： soil microbe； DNA extraction； PCR； DGGE

收稿日期：2013-05-10

作者簡介：周偉（1981-），男，河南南陽人，講師，主要從事遺傳學方面的研究，（電話）13938025634（電子信箱）luohezhouwei@126.com。

微生物在土壤生態系統物質循環和能量轉化過程中起重要作用，目前通過純培養技術只能獲得土壤中僅極少數的微生物種類，不能充分體現微生物群落的真實組成[1]。而基于DNA分析的分子生物學技術的引入，降低了對培養技術的依賴性，可以直接對土壤中微生物進行研究[2]。由于土壤中含有大量理化性質復雜的物質，而且微生物與土壤顆粒吸附緊密，不易從中提取DNA；同時土壤中微量的腐殖酸和重金屬可能抑制分子生物學操作過程中酶的活性、降低轉化效率以及DNA的雜交特異性[3，4]等。因此，從土壤樣品中高效地獲得高質量的DNA是后期土壤微生物分子生物學研究的前提。

土壤中微生物DNA提取的關鍵在于細胞的裂解，本研究通過對不同的裂解手段進行組合，設計了3種從土壤中直接提取微生物總基因組DNA的方法并對后期擴增效果進行比較分析，以期建立一種高效、簡便的土壤微生物DNA提取方法，為分子水平上研究土壤微生物提供參考。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

2011年在河南省漯河市孟廟鎮進行取樣。供試土壤取自常年以冬小麥-春玉米茬口種植的農田，秸稈全部還田，采用五點取樣法取土樣，取樣深度為0～20 cm，混勻后于-20 ℃保存。

1.2 試劑與儀器

溶菌酶、蛋白酶K購自Sigma公司，所用maker（λ-HindⅢ digested Marke，DNA Marker DL 2000）、凝膠回收試劑盒、PCR Kit購自TaKaRa公司。TGRADIENT溫度梯度PCR儀為德國Biometra公司生產，全自動數碼凝膠成像與分析系統由天能科技（上海）有限公司生產。

1.3 方法

對提取土壤微生物DNA方法中不同的細胞裂解方式進行組合，設計3種土壤基因組DNA的提取方法。

方法a：酶法與化學法相結合[5]。5 g土壤中加入25 μL蛋白酶K、13.5 mL TENC（50 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl、1% CTAB），混勻后置于37 ℃搖床225 r/min震蕩30 min；然后加入1.5 mL SDS混勻，65 ℃水浴震蕩2 h；6 000 r/min離心15 min，取上清液。原離心管中加入9 mL TENC、1 mL SDS，混勻后水浴1 h，6 000 r/min離心15 min，取上清液。合并所得上清液，加入等體積的氯仿/異戊醇，充分混勻后10 000 r/min離心15 min，取上清液，等體積加入異丙醇，混勻后放入冰箱中4 ℃過夜，10 000 r/min離心15 min，棄上清，加入2 mL預冷的70%乙醇洗滌2次，干燥后加入500 μL TE溶解。

方法b：化學法和凍融法結合使用[6]。5 g土壤中加入20 mL TENS（50 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl、1% SDS），70 ℃水浴1 h，6 000 r/min離心10 min，取上清液。在沉淀中加入1.5 mL TEN（50 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl），放置在-20 ℃冰浴和65 ℃水浴中反復凍融，循環5次。10 000 r/min離心10 min，取上清液。合并所得上清液，后續DNA溶解步驟與方法a相同。

方法c：酶法、化學法及凍融法配合使用[7]。5 g土壤中加入10 mL PBS，混勻后置于30 ℃搖床150 r/min震蕩15 min，10 000 r/min離心20 min，棄上清液。取沉淀加裂解液Ⅰ（50 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、100 mmol/L EDTA）7.5 mL，50 mg/mL溶菌酶2.5 mL，37 ℃水浴2 h，10 000 r/min離心15 min取上清液。沉淀加裂解液Ⅱ（0.15 mol/L NaCl、0.5 mol/L Tris-HCl、10% SDS）10 mL，循環放置在 -20 ℃冰浴和65 ℃水浴中反復凍融，循環3次，10 000 r/min離心15 min取上清液。合并上清液，后續DNA溶解步驟與方法a相同。

1.4 DNA質量與純度的檢測

提取的DNA通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，120 V電泳45 min，凝膠成像系統中觀察結果并拍照。DNA純度采用紫外分光光度計法進行比較，將所溶解的DNA溶液分別在230、260、280 nm波長下的吸光值進行測定。

1.5 不同提取方法對后期試驗適用性的分析

對細菌保守的16 S rDNA基因以及其V3可變區進行擴增，并對V3可變區進行DGGE電泳，根據PCR擴增效果以及DGGE電泳分離結果進行比較，分析3種提取方法所獲得的DNA是否適合后期分子生物學試驗。

1.5.1 PCR擴增及電泳本試驗所用16S rDNA引物為BR8-27（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′）和BL1541-1522（5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA

-3′），V3可變區引物為338L（5′-CTACGGGAGGCA

GCAG-3′）/518R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′），可對所有真細菌及大部分古細菌的相應目的片段進行有效擴增。PCR反應體系（50 μL）：10×PCR Buffer（含Mg+）5 μL，dNTP （2.5 mmol/L） 4 μL，引物（10 mmol/L）各1 μL，Taq酶（5 U/μL） 1 μL，土壤 DNA 1 μL，超純水定容至50 μL。16 S rDNA按以下循環程序擴增：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35次循環；72 ℃延伸5 min。V3可變區按以下循環程序擴增：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35次循環；72 ℃延伸5 min。反應結束后，分別取5 μL PCR產物于1.5%瓊脂糖凝膠上，80 V電壓下電泳15 min，電泳結束后在凝膠成像系統中觀察并拍照。

1.5.2 目的片段檢測用Bio-Rad公司的D-Code system基因突變檢測系統對V3可變區進行DGGE電泳分離，采用10%聚丙烯酰胺凝膠，變性劑梯度為40%～60%，加30 μL PCR產物，60 ℃，1×TAE，130 V電泳5 h，電泳凝膠采用銀染方法顯色。

2 結果與分析

2.1 基因組總DNA提取效果

利用3種方法提取土壤微生物DNA，電泳結果顯示（圖1）：方法a所得基因組DNA在23 130 bp左右出現一條較亮條帶，說明提取的DNA較完整；方法b所得產物出現較大范圍的彌散，表明DNA在提取過程中發生部分斷裂，影響了DNA的完整性和質量；而方法c得到的產物分子量低于4 000 bp，且較為分散，表明DNA在提取過程斷裂較為嚴重。

從土壤中提取的微生物DNA常含有蛋白質和腐殖酸，影響DNA的質量。OD260 nm/OD280 nm和OD260 nm/OD230 nm的值可分別檢測DNA中蛋白質和腐殖酸的污染程度，一般認為OD260 nm/OD280 nm在1.5～2.1之間，OD260 nm/OD230 nm大于2.0時說明所獲得的DNA具有較高純度。表1中結果表明，方法a提取的土壤微生物DNA OD260 nm/OD280 nm比值與理論值接近，蛋白質污染較輕，而OD260 nm/OD230 nm偏低，說明所提取的DNA存在一定程度的腐殖酸污染。方法b和方法c所得DNA的兩項比值均低于正常值，表明提取的土壤微生物DNA中腐殖酸含量較高，蛋白污染較嚴重。另外，OD260 nm數據顯示方法a所得DNA有最大吸收值。結果表明，3種提取方法中方法a所得土壤微生物DNA的純度和含量最高。

2.2 不同方法提取的DNA擴增效果檢測

用16 S rDNA基因以及其V3區通用引物進行PCR擴增，3種提取方法所得DNA對目的基因的擴增效果如圖2、圖3所示，方法a所提土壤微生物DNA擴增得到的PCR產物亮度較高，表明其產量及濃度較高，而方法b所提DNA擴增得到的產物亮度要比方法a弱很多，表明產物的量較少，擴增效果稍差，而方法c所得DNA擴增得到目的產物并沒有在電泳中觀察到，可能是由于產物的量過低，或沒有得到擴增，說明該方法提取的DNA質量較差。

2.3 PCR產物的DGGE電泳

通過DGGE電泳對擴增得到的16 S rDNA V3可變區進行分離，結果如圖4所示。由方法a所獲得的土壤微生物DNA經過PCR-DGGE電泳分離，能夠得到13條不同強度的條帶，而方法b所獲得的DNA只分離出7條。通過比較可以看出，方法a所獲得的分離條帶明顯較多，且分離結果清晰，通過DGGE電泳能夠較好地體現土壤中細菌組成的豐富程度以及種群分布的差異，而方法b所體現的微生物種類相對較少，但相應條帶所對應的種群密度與方法a保持一致。另外，方法b提取的DNA能夠分離出方法a沒有擴增到的條帶，說明這2種提取方法對部分細菌的裂解能力存在差異。由此可以推測，不同方法對細菌DNA的提取存在一定程度的選擇性，不可能完全體現出土壤中所有細菌的組成。

3 小結與討論

土壤微生物DNA提取方法主要可分為細胞提取法[8]和原位裂解法[9]。細胞提取法是先將細胞從土壤中分離出來，然后通過細胞裂解提取DNA。該方法雖然可得到純度較高的DNA，但由于絕大部分細菌與土壤顆粒吸附牢固，不宜洗脫，導致細胞產量低，提取的DNA量少，反映的微生物群落具有片面性。原位裂解法是直接對土壤樣品進行裂解提取基因組DNA，該方法提取的DNA一般產量較高，能夠更好地反映土壤中微生物的群落組成，但是由于在提取過程中會有一些土壤有機成分被提取出來，從而影響后期的分子生物學分析[10，11]。常用的原位裂解方法包括化學法、酶法或物理法，各種方法的作用原理不同，因而其提取效果也各有差異。化學法主要通過化學試劑對細胞進行破碎和DNA抽提，酶法主要通過酶的作用造成細胞裂解，而物理法則是通過外力作用使細胞破裂，本試驗采用的3種方法分別基于不同的裂解原理進行組合。

在這3種裂解原理中，化學法相對溫和，但對不同類型細胞裂解能力不同；酶法對細胞破裂具有專一性，但活性易受土壤中化學成分的影響；物理方法能徹底破碎細胞，但裂解時對DNA剪切程度比較大[12，13]，本試驗的結果也證實了以上結論。化學試劑與酶的聯合使用，能夠對土壤中的DNA進行有效的裂解。由于化學裂解過程比較溫和，蛋白酶不但提高了對細胞的破碎能力，又降解了部分蛋白質，從而較好地保證了整個基因組DNA的完整性和純度。而在化學裂解過程中進行凍融，能夠使細胞充分破碎，DNA得率較高，但同時造成DNA斷裂。化學、物理和酶法聯合使用，雖然對細胞裂解效果較好，但同時使DNA片段大量斷裂，造成DNA的質量與提取效率過低。另外，CTAB法對去除蛋白質和其他污染物有較好的效果，使方法a所獲得的DNA純度較其他兩種方法要高。DNA質量的差異造成了以方法a為模板的擴增效果明顯優于其他兩種方法，擴增產物含量和質量均比較高，有利于后期分析試驗的進行。通過對3種方法提取土壤微生物DNA效果的電泳檢測比較，用2種不同引物對PCR擴增結果以及DGGE電泳結果進行比較，表明化學法和酶法聯合使用適宜提取土壤微生物的DNA。

參考文獻：

[1] VESICO P A， NIERZWICKI-BAUER S A. Extraction and purification of PCR amplifiable DNA from lacustrine subsurface sediments[J]. Journal of Microbiological Methods，1995，21（3）：225-233.

[2] 辜運富，張小平，涂仕華. 變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術在土壤微生物多樣性研究中的應用[J].土壤，2008，40（3）：344-350.

[3] 張珍妮，吳曉芙，陳永華，等.DGGE技術在環境微生物多樣性研究中的應用[J].生物技術通報，2009（12）：48-52.

[4] SMALLA K， CRESSWELL N， MENDONCA-HAGLER L C， et al. Rapid DNA extraction protocol from soil for polymerase chain reaction-mediated amplification[J]. Journal of Applied Bacteriology，1993，74（1）：78-85.

[5] ZHOU J， BRUNS M A， TIEDJE J M. DNA recovery from soils of diverse composition[J]. Applied and Environmental Microbiology，1996，62（2）：316-322.

[6] KUSKE C R， BARNS S M， BUSCH J D. Diverse uncultivated bacterial groups from soils of the arid southwestern United States that are present in many geographic regions[J]. Applied and Environmental Microbiology，1997，63（9）：3614-3621.

[7] TSAI Y L， OLSON B H. Rapid method for direct extraction of DNA from soil and sediments[J]. Applied and Environmental Microbiology， 1991，57（4）：1070-1074.

[8] STEFFAN R J， ATLAS R M. DNA amplification to enhance detection of genetically engineered bacteria in environmental samples[J]. Applied and Environmental Microbiology，1988，54（9）：2185-2191.

[9] VESCIO P A， NIERZWICKI-BAUER S A. Extraction and purification of PCR amplifiable DNA from lacustrine subsurface sediments[J]. Journal of Microbiological Methods，1995，21（3）：225-233.

[10] STEFFAN R J， GOKSOYR J， BEJ A K， et al. Recovery of DNA from soils and sediments[J]. Applied and Environmental Microbiology，1998，54（12）：2908-2915.

[11] 張靜文，羅明，徐文修，等.用于微生物多樣性分析的棉田土壤總DNA的提取[J].生物技術，2009，19（5）：34-37.

[12] MORE M I， HERRICK J B， SILVA M C. Quantitative cell lysis of indigenous microorganisms and rapid extraction of microbial DNA from sediment[J]. Applied and Environmental Microbiology，1994，60（5）：1572-1580.

[13] WECHTER P， WILLIAMSON J， ROBERTSON A， et al. A rapid， cost-effective procedure for the extraction of microbial DNA from soil[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2003，19（1）：85-91.

（責任編輯趙娟）