強迫游泳應激對大鼠甲狀腺激素及垂體促甲狀腺激素β亞基表達水平的影響

姜雅秋，姜雷，郭新紅，王安邑，孫秋巖

（中國醫科大學1.附屬第一醫院內分泌科，沈陽110001；2.保健科，沈陽110122）

強迫游泳應激對大鼠甲狀腺激素及垂體促甲狀腺激素β亞基表達水平的影響

姜雅秋1，姜雷2，郭新紅1，王安邑1，孫秋巖1

（中國醫科大學1.附屬第一醫院內分泌科，沈陽110001；2.保健科，沈陽110122）

目的探討強迫游泳應激對Wistar大鼠甲狀腺功能及垂體促甲狀腺激素（TSH）β亞基（TSHβ）蛋白和mRNA表達水平的影響。方法選擇6周齡Wistar雄性大鼠隨機分成5組，除對照組外，強迫游泳10 min后分別于10 min、2 h、12 h及24 h斷頭，取血，化學發光分析法測定各組大鼠血清TSH、游離三碘甲腺原氨酸（FT3）和游離甲狀腺素（FT4）水平；留取各組Wistar大鼠垂體，應用免疫組織化學染色檢測TSHβ蛋白表達水平，垂體組織勻漿應用實時定量PCR分析TSHβmRNA表達水平。結果強迫游泳后2 h組、12 h組和24 h組血清FT3、FT4均升高，較對照組均無統計學差異（P＞0.05），10 min組、2 h組及24 h組血清TSH水平較對照組無明顯變化，但12 h組較其余各組均明顯升高（P＜0.05）。垂體TSHβ蛋白及mRNA表達強迫游泳后12 h組也較其他組明顯升高（P＜0.05）。結論強迫游泳應激可影響Wistar大鼠甲狀腺功能，使血中甲狀腺素水平升高。強迫游泳應激后Wistar大鼠垂體TSHβ蛋白及mRNA表達水平增加，峰值出現在12 h。提示丘腦-垂體-甲狀腺軸可能在急性心理和生理應激時同樣發揮重要的調節作用。

游離三碘甲腺原氨酸；游離甲狀腺素；促甲狀腺激素；促甲狀腺激素β亞基

甲狀腺素不僅在細胞的代謝、氧消耗，組織的生長、成熟和分化以及人體脂肪、碳水化合物代謝調節等方面起重要作用［1］，下丘腦-垂體-甲狀腺軸（hypothalamus-pituitary-thyroid，HPT）也構成了人體應激反應系統的重要一環［2，3］。隨著神經內分泌調控及其機制研究的進展，應激對機體的負面作用也越來越被人們重視，有研究發現心理應激可明顯降低機體的免疫功能［4］。在引起機體各種急性應激的突發重病發生時，血里的三碘甲腺原氨酸（triiodothyronine，T3）往往會偏低（低T3綜合征）［5］；有學者通過對心臟病患者的研究發現低T3血癥是其預后不良與死亡的獨立風險因子［6］，而最近一些研究發現對難治抑郁癥進行抗抑郁藥物治療時若能加用T3則能使療效顯著增高［7］。目前關于應激與甲狀腺激素水平的研究結果不一，一些使用輕微刺激（如心理應激、慢束縛實驗等）的實驗發現外周血甲狀腺激素水平輕微增加或無明顯變化，一些使用較重程度刺激（如電擊刺激等）的實驗則發現外周血甲狀腺激素水平降低［3］，有學者認為這表現了HPT軸對應激強度及密度的敏感性［8］。本研究通過分析強迫游泳應激后外周血游離甲狀腺素（free thyroxin，FT4）、游離三碘甲腺原氨酸（free triiodothyronine，FT3）、促甲狀腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH）、垂體TSH β亞基（TSHβ）蛋白及其mRNA表達的變化，綜合探討急性應激對HPT軸的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6周齡SPF級Wistar雄性大鼠38只，體質量250～280 g。實驗前自由飲食水，飼養于12 h/12 h明暗循環環境中。實驗前1周開始每天撫摸動物5 min，以使大鼠習慣實驗者。隨機分為5組，第1組（n=8）：對照組，當日斷頭，心臟取血；第2組～第5組：分別于26℃溫水中強迫游泳10 min后立即（n= 7）、2 h（n=7）、12 h（n=8）、24 h（n=8）斷頭取垂體，心臟取血。垂體組織快速冷凍，保存于-70℃備用。血標本立即于0℃、3 000 r/min離心取血漿，保存于-20℃備用。實驗在8：00～12：00內進行。

1.2 方法

1.2.1 血中激素測定：血清FT3、FT4及TSH應用化學發光法測定。

1.2.2 垂體TSHβ冰凍切片免疫組化染色：從-70℃冰箱取出組織，4%的多聚甲醛-PBS（pH7.4）固定1 h；0.01 mol/L PBS洗；3%H2O2去離子水孵育10 min，0.01 mol/L PBS洗；滴加一抗（1∶100），37℃水浴箱孵育90 min；0.01 mol/L PBS洗；滴加試劑PV9003于4℃冰箱孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗；DAB顯色，自來水終止反應后，蘇木素復染；返藍；封片；采用圖像分析系統Image-Pro Plus 5.1對冰凍切片染色結果進行定量檢測，檢測各組大鼠垂體陽性表達染色的平均光密度，以每組標本15個視野的累積光密度（IOD）的平均值作為該例的測量值。

1.2.3 垂體TSHβmRNA實時定量PCR：組織勻漿；兩相分離：12 000 r/m、4℃離心15 min，小心吸取上層水相至新的1.5 mL RNase Free的EP管中；上清液中加入200 μL-20℃預冷的氯仿，混勻，待充分乳化溶液呈乳白狀后，室溫靜置5 min；12 000 r/m、4℃離心20 min；吸取最上層透明水相至新的1.5 mL RNase Free的EP管中。RNA沉淀：向上述的水相中加入400 μL異丙醇，混勻，12 000 r/m、4℃離心10 min；RNA清洗：棄去上清，加入1 mL DEPC水配制的75%乙醇（已-20℃預冷），12 000 r/m、4℃離心5 min，棄上清，干燥；RNA融解：再加入20 μL DEPC水溶解。RNA的純度鑒定及含量測定：取RNA樣品2 μL加入198 μL DEPC水后，以紫外分光光度計測260 nm和280 nm OD值，計算OD260/OD280比值，若其值＞1.8，則視為提取的RNA純度可用。mRNA逆轉錄合成cDNA：Total RNA根據原始濃度稀釋為100 ng/μL，根據逆轉錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent kit）的說明書將抽提的總RNA逆轉錄合成cDNA。實時PCR分析大鼠垂體組織中TSHβmRNA表達水平。設計引物根據美國NCBI數據庫基因序列信息，用引物設計軟件Primer 5.0分別設計出TSHβ和GAPDH基因的引物，由大連寶生物工程公司合成并純化。為保證實驗的標準化，在PCR反應中同時擴增一內源性參照基因。在TSHβ基因表達研究中，本研究選擇看家基因GAPDH為內參基因。反應結束后確認實時PCR的擴增曲線，并要求溶解曲線為單峰；標準曲線R2≥0.98；擴增效率E≥2.0之間；陰性對照無熒光信號；應用LightCycler 480軟件選擇“Advanced Relative Quantitation”分析路徑對目的基因mRNA表達的差異進行分析。

1.3 統計學方法

數據采用SPSS17.0統計學軟件進行處理、分析，所有數據均采用表示，采用單因素方差分析與t檢驗進行比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清FT3和FT4水平

強迫游泳應激后2 h組、12 h組和24 h組血清FT3、FT4均較對照組有所升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 血清TSH水平

血清TSH水平10 min組、2 h組較對照組無明顯變化（P＞0.05），但12 h組TSH水平明顯升高，與對照組、10 min組及2 h組比較有統計學差異（P＜0.05），但游泳應激后24 h血清TSH水平與12 h相比明顯降低，有統計學差異（P＜0.05），且24 h血清TSH水平基本恢復到應激前水平（表1）。

2.3 垂體TSHβ表達水平

垂體TSHβ表達水平以IOD表示，10 min組與對照組比較無明顯變化，2 h組較對照組升高，有統計學差異（P＜0.05），12 h組較對照組、10 min組及2 h組明顯升高，有統計學差異（P＜0.05）。24 h組較12 h組有所降低，有統計學差異（P＜0.05），但較對照水平仍升高，未恢復到應激前水平（表1，圖1）。

表1 強迫游泳應激后血清FT3、FT4、TSH及垂體TSHβ表達水平的變化Tab.1 Change of serum FT3，FT4，TSH and pituitary TSHβ expression level after forced swimming stress

圖1 垂體TSHβ免疫組化染色×400Fig.1 Immunohistochemical staining of pituitary TSHβ×400

2.4 大鼠垂體TSHβmRNA表達水平

TSHβmRNA在大鼠垂體組織中的表達水平各實驗組較對照組升高，有統計學差異（P＜0.05），24 h組較12 h組有所降低，但較對照組水平仍升高，未恢復到應激前水平。見圖2。

圖2 強迫游泳應激后垂體TSHβmRNA表達水平的變化Fig.2 Dynamic change of pituitary TSH βmRNA expression level after forced swimming stress

3 討論

本研究探討強迫游泳應激對HPT軸功能變化的影響，研究中發現強迫游泳應激可使外周FT3、FT4及TSH增加，同時垂體TSH表達也增加。

有研究報道強迫游泳應激可使HPT軸中糖皮質激素的分泌于短期內明顯增加并恢復正常，即強迫游泳應激10 min后糖皮質激素較前明顯增加，但2 h后恢復到基礎水平［9］。我們應用相同的應激形式及強度處理大鼠來研究對HPT軸功能的影響，結果提示強迫游泳應激對HPT軸的影響隨時間的動態變化是不同的，TSH的升高較促腎上腺皮質激素的變化出現的慢而且持續時間較長，24 h后仍未恢復到基礎水平。

一般認為，甲狀腺激素起作用時間在數日到數周內，近來的研究發現甲狀腺激素的短暫改變也可能造成一些明顯后果，如對大鼠腹膜內注射T3能導致其海馬內BDNFmRNA在2 h內顯著變化［10］，皮下注射2 h內發現大鼠食量增加［11］，此外T3對海馬神經活性變化的影響也被證實［12］。這些甲狀腺激素的急性作用可能通過基因調控的細胞膜受體而起作用，但也可能不通過此途徑起作用［13］。

本研究發現Wistar大鼠在強迫游泳后12 h出現T3、T4以及TSH增高。學者曾發現較輕的刺激（如心理、慢性束縛等）能引起大鼠血中甲狀腺激素水平升高，與本研究結果相似。我們利用實時定量PCR測定垂體TSHβmRNA表達水平和血中TSH水平趨勢略有不一致，可能由于合成與釋放不同步，或是部分來自其脈沖式釋放的特性。垂體TSHmRNA表達的增高再次證明了應激對HPT軸產生的影響，解釋了TSH增高的一個可能來源，未來應進一步探討游泳應激對下丘腦室旁核促甲狀腺激素釋放激素的含量及表達的影響。

很多應激源如寒冷、高熱都可以直接通過中樞溫度感受器直接作用于HPT，促甲狀腺激素釋放激素、TSH相繼釋放，使甲狀腺激素分泌增加。急性應激可能主要通過藍斑-交感-腎上腺髓質系統整合分析作出應答，進而興奮交感神經，加速腎上腺髓質功能，使血漿中兒茶酚胺的濃度迅速升高，進而刺激甲狀腺激素分泌有關。多數認為長期應激導致的甲狀腺激素，尤其是T3的降低與下丘腦-垂體-腎上腺軸密切相關。

游泳應激對HPT軸功能影響的機制尚待進一步研究。在應激的經典模型中，皮質醇激素會表現出顯著增高，有研究發現其能在垂體水平對TSH的釋放產生影響，但也有研究認為這個作用發生在下丘腦水平［14，15］。對腎上腺切除的動物重復這種應激實驗可能可以進一步對此類機制作出解釋。

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（編輯 陳姜）

EffectofForced Swimming Stresson Thyroxineand the Expression ofThyroid-stimulating Hormone βSubunitin Pituitary of Rat

JIANGYa-qiu1，JIANGLei2，GUOXin-hong1，WANGAn-yi1，SUNQiu-yan1
（1.Department of Endocrinology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Out-patient Department，China Medical University，Shenyang 110122，China）

ObjectiveTo clarify changes in the blood leveloftriiodothyronine（T3），thyroxin（T4），and expression levelofthyroid-stimulating hormone（TSH）β subunit（TSHβ）mRNA at pituitary in Wistar rats after forced swimming stress.MethodsMale Wistar rats with an age of 6 weeks were randomly divided into five groups（10 min，2 h，12 h，24 h，control group）depending on the time delayed after the 10-minute forced swimming.Blood was collected for serum TSH measurement by chemiluminescent immunoassay，pituitary tissue was excised for measurement of TSH expression by immunohistochemistry assay，pituitaries were also excised for extraction of total RNA.Real-time PCR was performed for quantification ofTSHβmRNA.ResultsSerum T4and T3in the 2 h，12 h and 24 h groups increased after forced swimming stress，but the increase was not significant as compared with that of the control group（P＞0.05）.Serum TSH of the 12 h group increased significantly compared with those of the other groups（P＜0.05），but no significant change were noticed between the 10 min，2 h，24 h groups and the control group.TSHβmRNA expression at pituitary showed similar results.ConclusionForced swimming stress influenced the function of pituitary in Wistar rats，leading to increased serum thyroxin level.After forced swimming stress，the TSHβ concentration and mRNA expression level at pituitary in Wistar rats increased（peaked after 12 h），suggesting an importantregulatory role ofthalamus-pituitary-thyroid axisunderacute psychologicaland physiologicalstress.

free triiodothyronine；free thyroxin；thyroid-stimulating hormone；thyroid-stimulating hormone β subunit

R714.1

A

0258-4646（2014）12-1088-04

遼寧省高等學校創新團隊項目（LT2012015）

姜雅秋（1968-），女，教授，博士. E-mail：jiangyaqiu@yeah.net

2014-10-09

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