孵化基質pH對紅耳龜和中華條頸龜孵化及血液生理指標的影響

李燕華+傅麗容+史海濤

摘要：為了探討土壤酸化對紅耳龜（Trachemys scripta elegans）和中華條頸龜（Mauremys sinensis）孵化及稚龜血液生理指標的影響，在孵化溫度為（30±0.5） ℃，孵化基質pH分別為4、5、6、7的條件下，對比研究了兩種龜卵孵化率、畸形率、孵化期和血液生理指標的變化。結果表明，兩種龜卵孵化率均隨孵化基質pH的降低而降低，pH為4時可使胚胎致死，pH為7、6、5處理同種龜不同處理間和同種處理不同種之間孵化率差異不顯著（P>0.05）；pH降低紅耳龜孵化期縮短，胚胎發育加速，胚胎發育正常，而中華條頸龜畸形率升高（P<0.05）；兩種稚龜血細胞變化不同，紅耳龜紅細胞長、短徑變長，長短徑比增加，紅細胞數、白細胞數顯著增加（P<0.05），中華條頸龜各項血液生理指標差異不顯著。對比研究各項指標可知，紅耳龜通過減少畸形率、提高急性應激刺激閾值，增強了對酸脅迫的耐受性。

關鍵詞：紅耳龜（Trachemys scripta elegans）；中華條頸龜（Maurenmys sinensis）；酸堿度；孵化；血細胞

中圖分類號：Q959.6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）01-0149-04

Effect of Hatching Matrix pH on Hatching and Blood Physiological Indexes of Trachemys scripta elegans and Mauremys sinensis

LI Yan-hua，Fu Li-rong，SHI Hai-tao

（College of Life Sciences， Hainan Normal University， Haikou 571158， China）

Abstract： In order to explore the effects of soil acidification on egg hatching and baby blood physiological indexes of Trachemys scripta elegans and Mauremys sinensis， the experiment incubation temperature was（30±0.5） ℃，and pH of incubation matrix was 4， 5， 6， 7. Under these conditions， hatching rate， deformity rate， incubation period and blood physiological changes of the turtle eggs of both species were compared. The results showed that hatching rates of both species decreased as pH of hatching matrix decreased， and embryos were dead when pH was 4. There were no significant differences among turtles in different treatments of the same species and the same treatments of different species in condition of pH 5， 6， 7（P>0.05）； When pH decreased， hatching period of Trachemys scripta shortened， their embryos， growth accelerated in normal order while， deformity rate of Mauremys sinensis increased（P<0.05）. Blood cells of the two baby turtles changed differently. Both length-diameter and short diameter of Trachemys scripta elegans red cell became longer， ratio of length-diameter and short diameter increased， and the quantity of red cell and white cell increased significantly（P<0.05）. The comparative study of these indicators showed that trachemys scripta elegans enhanced tolerance to acid stress through reducing deformity rate and improving threshold of acute stress stimulation.

Key words： Trachemys scripta elegans； Mauremys sinensis； pH； hatching； blood cell

收稿日期：2013-07-16

基金項目：國家自然科學基金國際地區重大合作項目（30910103916）；海南省自然科學基金項目（310040）

作者簡介：李燕華（1983-），女，河北邯鄲人，實驗師，碩士，主要從事動物生理研究，（電話）18789086177（電子信箱）green.wudi@163.com；

通訊作者，傅麗容（1964-），女，教授，主要從事動物繁殖生理研究，（電子信箱）flr@hainnu.edu.cn；史海濤（1963-），男，教授，博士，

主要從事兩棲爬行動物生態學與保護生物學研究，（電子信箱）haitao-shi@263.net。

酸雨現已成為嚴重威脅世界環境的十大問題之一[1]，國內外許多學者的大量研究結果表明，酸雨對地球和脆弱的生態系統（包括海洋生態系統）造成了嚴重的威脅[2，3]。血液作為衡量動物體對環境適應狀況、健康以及營養狀況重要指標，在環境脅迫下變化尤其明顯[4]。研究表明pH的下降能使魚類血液紅細胞載氧能力隨之減弱[5]；影響膜蛋白的功能，使紅細胞脆性增大，更易破裂[5]；還會抑制鯉魚鰓組織酶活力，使體重下降[6]。酸雨造成的土壤酸化對土壤動物的生存也造成嚴重的威脅[7，8]，Marco等[9]對蜥蜴（Pogonu vitticeps）的研究表明，土壤pH的改變可能影響到卵與周圍環境的水分和氣體交換，或者直接改變卵內部的pH，最終影響到胚胎發育。而胚胎發育是動物生活史中的重要時期，也是對生態因子最敏感的時期[10]。龜鱉類動物卵生且無護卵行為，體外自然孵化，環境因子對孵化具有更大的影響[10]。所以，酸雨所導致的土壤酸化對龜鱉類動物在胚胎發育期的毒害作用不可忽視。

紅耳龜（Trachemys scripta elegans）列為世界最危險的100個外來入侵物種之一[11]，其適應力強、生長速度快、高繁殖、易存活，與本地土著龜——中華條頸龜（Maurenmys sinensis）具有相似的生態位[12]，在野外情況下可存在于相同生境中[13]。當面臨日益嚴重的酸雨所導致的土壤酸化脅迫時，處于胚胎發育期的兩種龜對環境脅迫的耐受性及適應能力如何，目前還未見相關報道。本試驗模擬了土壤酸化對紅耳龜和中華條頸龜的胚胎期造成脅迫，通過對比研究檢測兩種龜孵化和稚龜血液指標變化，探討紅耳龜和中華條頸龜對酸性環境的耐受性，從生理學角度分析紅耳龜入侵的機制，對防止紅耳龜的入侵具有一定的指導意義，為保護物種多樣性奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用紅耳龜與中華條頸龜卵各120枚，2011年4月9日購自海南省文昌順利農漁科技公司，胚盤明顯，發育正常。

1.2 試驗設計

選用蛭石孵化基質，以0.1 mol/L HCl調制蛭石，設置3個試驗濃度組，試驗組pH分別為4、5、6，對照組pH為7。將紅耳龜與中華條頸龜卵各隨機分成4組，每組30枚，置于智能生化培養箱中孵化。1周后剔除未受精卵，孵化溫度保持在（30.0±0.5） ℃，空氣相對濕度為85%，每日用IQ150土壤原位pH計測定孵化基質pH并做相應的調節，以保證孵化盒內基質pH的恒定。

1.3 孵化指標和血液生理指標檢測

記錄每只龜卵的孵化時間，統計并計算不同pH處理龜卵的孵化率、畸形率和孵化期。稚龜孵出24 h后進行血液生理指標的檢測，包括血細胞計數和常規血涂片制作。

1.4 數據分析

數據利用Excel 2003和SPSS 16.0進行處理，所有試驗數據均以±SD表示。（1）Kruskal-Wallis多獨立樣本非參數檢驗和χ2-檢驗不同pH處理對胚胎孵化率、畸形率的影響和血細胞數量變化；（2）方差分析（ANOVA）結合LSD法，檢驗不同孵化基質pH對胚胎孵化期的影響和血細胞形態變化。

2 結果與分析

2.1 基質pH對兩種龜卵孵化率、畸形率和孵化期的影響

由表1可知，pH 4組的兩種龜卵孵化率均為0，pH 7、pH 6、pH 5組隨著pH的降低，兩種龜卵孵化率均呈下降趨勢，經Kruskal-Wallis多獨立樣本非參數檢驗差異不顯著（χ2=2.01，df=1，P>0.05；χ2=0.13，df=1，P>0.05）。相同pH下，紅耳龜孵化率低于中華條頸龜，差異不顯著（P>0.05），說明孵化基質pH在一定范圍內對稚龜胚胎發育有一定影響，過低的pH可使胚胎致死。

不同的pH處理，紅耳龜發育正常，中華條頸龜出現畸形龜，畸形率隨pH降低呈升高趨勢。pH 5組，中華條頸龜畸形率極顯著高于紅耳龜（P<0.01）。紅耳龜與中華條頸龜均表現出隨pH降低，孵化期縮短。紅耳龜孵化期pH 5組顯著短于pH 7、pH 6組（P<0.05），中華條頸龜各組間差異不顯著（P>0.05），說明低pH可縮短孵化期，影響紅耳龜胚胎的發育速度。

2.2 基質pH對孵化稚龜血細胞形態的影響

測定兩種稚龜紅細胞長短徑比，比較不同孵化基質pH處理下紅細胞形態的變化（表2）。單因素方差分析表明，不同pH處理紅耳龜稚龜紅細胞形態差異顯著（P<0.05）。紅耳龜稚龜pH 5組紅細胞長短徑比為1.72±0.19，顯著高于pH 6組1.64±0.17和pH 7組1.59±0.14，并表現出隨pH降低，長短徑比逐漸增大的規律。中華條頸龜稚龜紅細胞長短徑比差異不顯著（P>0.05），形態差異不明顯（P>0.05）。

2.3 基質pH對孵化稚龜血細胞數量的影響

孵化基質pH顯著影響紅耳龜稚龜紅細胞、白細胞數量見表3。pH 7、pH 6、pH 5組紅細胞數分別為（5.65±0.69）×1011、（6.36±0.99）×1011、（6.86±1.33）×1011個/L，隨pH降低，紅細胞數增多，且紅細胞形態變化一致；白細胞數量隨pH降低而增多，分別為（7.48±1.19）×109、（7.56±0.88）×109、（8.23±1.11）×109個/L。中華條頸龜稚龜的紅細胞、白細胞數量變化不明顯（P>0.05）。

兩種稚龜血涂片觀察均可見嗜中性、嗜酸性、嗜堿性、單核和淋巴5類白細胞。不同pH處理白細胞數量的不同主要表現在不同種類的白細胞所占的比例不同。低pH處理使紅耳龜嗜中性粒細胞和淋巴細胞變化明顯，pH 5組嗜中性粒細胞高于pH 7、pH 6組（P<0.05）；淋巴細胞低于pH 7、pH 6組（P<0.05）。中華條頸龜白細胞總數及各類白細胞所占比例差異不顯著（P>0.05）。

3 小結與討論

3.1 孵化基質pH對胚胎發育孵化率、畸形率和孵化期的影響

孵化環境影響孵化成功率、孵化期和幼體的大小、行為、生長等[14]，pH是影響胚胎發育重要生態因子之一[15]。研究表明，隨著孵化環境pH的降低通常會影響水生動物的胚胎發育甚至導致畸形和死亡率的增加[15-17]。本試驗中隨孵化基質pH降低，兩種龜死亡率均呈上升趨勢，pH 4孵化基質可使胚胎致死。這與Peterson等[18]對大西洋鮭（Salmo salar）、Allan等[19]對斑節對蝦（Penaeus monodon）的研究結果一致。這可能是因為過低pH條件下酶的活性受抑制，影響新陳代謝水平，從而影響胚胎發育，并且過低的pH使卵膜軟化，失去彈性，胎易破膜死亡[20]，而微酸、中性環境對稚龜孵化率影響較小[21]。

酸脅迫環境下中華條頸龜稚龜出現畸形，畸形率顯著高于紅耳龜，可能與它們的卵殼結構不同有關。中華條頸龜為硬殼卵，通透性強，隨高濃度氫離子濃度的增加，影響胚胎的滲透壓平衡，使新陳代謝水平失調，造成卵膜某一結構破壞或功能喪失[15]。畸形個體在野外生存過程中自然比正常個體的適應性要差，紅耳龜在這一方面是占據優勢的。孵化期方面，紅耳龜孵化期縮短使其比處在同一生態位的中華條頸龜更早搶奪食物、棲息地等資源。在自然界，孵化期越長，受到敵害和惡劣氣候破壞的機會越多，縮短孵化期對動物具有重要意義。因而從畸形率、孵化期來說，酸脅迫對中華條頸龜的不利影響大于紅耳龜。

3.2 孵化基質pH對兩種龜血細胞形態的影響

血細胞是動物機體對自身生理狀態變化和對外界環境因子刺激非常敏感的細胞，在載氧、機體免疫和凝血中起著重要的作用[22]。有研究表明，隨pH的減小，紅細胞吸水膨脹，使其形態指標值逐漸增大[23]。這與pH 7、pH 6、pH 5組紅耳龜紅細胞長、短徑及二者比逐漸增大的結果一致。隨著pH降低，紅耳龜紅細胞數量增多，中華條頸龜變化不明顯，可能是與酸脅迫環境有關。長期以來一直認為酸性水體可使魚類血液中的pH下降，使一部分血紅蛋白與氧的結合受阻，從而減弱其載氧能力[24]。所以，pH的降低有可能會使稚龜胚胎缺氧，使貯藏性紅細胞釋放[25]，紅細胞增多是一種獲得缺氧代償能力的表現[26]。另外，紅細胞尚具有一定的非特異性免疫能力[27]。紅耳龜血紅細胞的增多是對惡劣環境的一種應激反應。

研究表明，機體可對外界或內部的各種異常刺激產生非特異性應答反應，在酸性環境下孵化可使兩種胚胎受到刺激，發生急性或慢性應激反應[28]。受到急性刺激后，通過下丘腦-垂體-腎上腺皮質（HPA）軸產生糖皮質激素[29]。其中皮質酮可通過影響血漿中白細胞和抗體的數量而對免疫能力產生影響。當急性刺激轉變成慢性刺激時，HPA的負反饋調節則會鈍化甚至失效，慢性應激發生。由此引發的一系列副反應將對機體產生毒害作用[30]，已有大量試驗證明，長期高水平的皮質酮可抑制鳥類的繁殖和免疫能力。紅耳龜中嗜中性粒細胞增加體現了正常的免疫防御機制。中華條頸龜的白細胞數量隨pH降低而增多，但差異不顯著，正是免疫抑制的體現。由于中華條頸龜經歷了由急性應激到慢性應激的轉變，說明了其急性刺激閾值低于紅耳龜，更易受到酸脅迫環境的不利影響。

由此可見，當胚胎發育過程中面對酸脅迫時，紅耳龜較低的畸形率和縮短的孵化期特征都是有利于自身生存的，優于中華條頸龜，并以具有較高急性刺激閾值的特點，比中華條頸龜較少受到酸脅迫的不利影響，表現為較強的耐受性。

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（責任編輯 屠 晶）

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