產(chǎn)植酸酶枯草芽孢桿菌ZX—29產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化

王樹香+李術(shù)娜+李紅亞

摘要：試驗研究了產(chǎn)植酸酶枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ZX-29的芽孢產(chǎn)率及芽孢數(shù)量，采用單因素試驗和正交試驗對該菌產(chǎn)芽孢條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，該菌搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)芽孢的最佳條件為：培養(yǎng)基成分：0.5%可溶性淀粉、2.0%蛋白胨、0.10% KH2PO4和0.05% MnSO4·H2O；培養(yǎng)條件：pH 8.0、種齡20 h、裝瓶量30 mL（250 mL三角瓶）。在此優(yōu)化條件下，發(fā)酵液中該菌株的芽孢數(shù)量達到6.4×109個/mL，芽孢產(chǎn)率達到97.61%。

關(guān)鍵詞：植酸酶；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ZX-29；發(fā)酵；芽孢

中圖分類號：TQ920.6；Q939.9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）01-0160-03

Optimization of Spore Production Conditions of Strain of Producing Phytase

Bacillus subtilis ZX-29

WANG Shu-xiang，LI Shu-na，LI Hong-ya

（College of Life Science， Hebei Agriculture University， Baoding 071001， Hebei，China）

Abstract： The sporulation rate and spore quantity of Strain of producing phytase B. subtilis ZX-29 were studied and the spore production process were optimized through single factor experiment and orthogonal experiment. The results showed that the optimal conditions of spore production were 0.5% Sorbitol， 2% Peptone， 0.1% KH2PO4 and 0.05% MnSO4·H2O， initial pH8.0， inoculating 20 h and filling 30 mL/250mL bottle the spore quantity of strain Bacillus subtilis ZX-29 achieves 6.4×109 per mL and the spore production rate achieved 97.61%.

Key words： phytase； Bacillus subtilis ZX-29； fermentation； spore

收稿日期：2013-06-19

基金項目：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)青年科學(xué)基金項目（QJ201233）

作者簡介：王樹香（1977-），女，河北唐山人，實驗師，碩士，主要從事農(nóng)業(yè)微生物、生物飼料和生物肥料方面的研究，（電話）15930281873

（電子信箱）wangshuxiang@hebau.edu.cn。

植酸酶（Phytase）在畜禽飼料生產(chǎn)中使用可解除植酸的抗營養(yǎng)作用，提高飼料中多種礦物元素和蛋白質(zhì)、氨基酸的可利用性，又能提高植酸磷的利用率，降低糞便磷排泄造成的環(huán)境污染[1]。植酸酶對人體吸收營養(yǎng)物質(zhì)具有明顯的促進作用[2]。近年來植酸酶開始應(yīng)用于植物性食品中，可達到分解植酸、平衡營養(yǎng)的作用[3]。

植酸酶是一類對熱敏感的酶類，制粒過程中高溫、高壓及高含水量可對其產(chǎn)生極大破壞，導(dǎo)致目前商品植酸酶存在價格昂貴、產(chǎn)量低、不耐高溫及產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等缺點[4]，因此獲得高熱穩(wěn)定性的植酸酶是近年來植酸酶工業(yè)的研究熱點和難點。在飼用植酸酶方面，篩選到能夠直接產(chǎn)耐高溫植酸酶的菌株是最佳方法。目前文獻報道已分離到的產(chǎn)植酸酶的芽孢桿菌產(chǎn)酶普遍較低，達不到預(yù)期用于發(fā)酵生產(chǎn)的目的，因此增加芽孢桿菌植酸酶的產(chǎn)量成為目前亟待解決的研究課題之一[5，6]。目前已有關(guān)于芽孢桿菌植酸酶產(chǎn)酶條件優(yōu)化的研究[7-11]，但仍不能達到預(yù)期可應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)的效果[12]。

近年的研究已證明枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ZX-29具有安全、高效、耐熱的特點。本試驗通過單因素試驗和多因素試驗對B. subtilis ZX-29菌株發(fā)酵產(chǎn)芽孢條件進行研究，旨在為其工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 B. subtilis ZX-29，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程實驗室分離篩選。

1.1.2 培養(yǎng)基 本試驗所用的培養(yǎng)基有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基等[13，14]。

1.1.3 測定方法 芽孢染色及生物量測定（血球計數(shù)板直接計數(shù)）均參照文獻[15]。

1.1.4 試驗方法 用單因素試驗確定B. subtilis ZX-29產(chǎn)芽孢最佳的碳源、氮源及無機鹽；按正交試驗L16（44）確定最佳的培養(yǎng)基成分；L16（34）確定最佳的培養(yǎng)條件[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對B. subtilis ZX-29菌株發(fā)酵產(chǎn)芽孢的影響

從圖1可看出，以可溶性淀粉作碳源時，B. subtilis ZX-29菌株芽孢和菌體的數(shù)量達到最高，芽孢產(chǎn)率為80.25%，說明可溶性淀粉作碳源有利菌體生長，因此最佳碳源選擇可溶性淀粉為宜。

2.2 氮源對B. subtilis ZX-29菌株發(fā)酵產(chǎn)芽孢的影響

從圖2可看出，培養(yǎng)48 h時，以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中芽孢的產(chǎn)率最高，為98.15%，而且各種氮源的芽孢產(chǎn)率差異較大，因此，選擇蛋白胨為B. subtilis ZX-29菌株產(chǎn)芽孢的最佳氮源。

2.3 無機鹽對B. subtilis ZX-29菌株發(fā)酵產(chǎn)芽孢的影響

從圖3可看出，不同的無機鹽種類對芽孢形成的影響差異較大。B. subtilis ZX-29在培養(yǎng)72 h時，KH2PO4試驗組中芽孢產(chǎn)率可達95.57%；銅鹽組中則既沒有菌體存在也無芽孢形成；MnSO4·H2O作為無機鹽時，其芽孢生成率也較高，可達到93.51%。試驗結(jié)果顯示KH2PO4為B. subtilis ZX-29菌株產(chǎn)芽孢的最佳無機鹽。但由于用KH2PO4做無機鹽時，雖然芽孢產(chǎn)率較高，但菌體的生長狀況欠佳，而以MnSO4·H2O作為無機鹽時，其芽孢產(chǎn)率較高，菌體生長狀況也較好，故B. subtilis ZX-29菌株培養(yǎng)基中的無機鹽采用KH2PO4和MnSO4·H2O的復(fù)合鹽為最佳。

2.4 B. subtilis ZX-29培養(yǎng)基成分優(yōu)化正交試驗結(jié)果

首先對B. subtilis ZX-29菌株不同培養(yǎng)時間進行芽孢計數(shù)，結(jié)果表明其發(fā)酵48 h時的芽孢產(chǎn)率達到90%以上，從而以發(fā)酵48 h的結(jié)果為代表進行正交分析。由表1可見，B. subtilis ZX-29菌株培養(yǎng)基最佳成分組成為：可溶性淀粉0.5%，蛋白胨2.0%，KH2PO4 0.10%和MnSO4·H2O 0.05%。

2.5 B. subtilis ZX-29培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果

以B. subtilis ZX-29菌株發(fā)酵48 h的結(jié)果為代表進行正交分析，B. subtilis ZX-29菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果見表2。由表2可見，B. subtilis ZX-29菌株最優(yōu)培養(yǎng)條件為：pH8.0、種齡20 h、裝瓶量30 mL。

2.6 B. subtilis ZX-29芽孢染色結(jié)果

按以上優(yōu)化條件對B. subtilis ZX-29菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，以血球計數(shù)板法測定其總生物量，并對所得芽孢進行孔雀綠染色和結(jié)晶紫染色觀察。觀察統(tǒng)計結(jié)果為：發(fā)酵液中B. subtilis ZX-29菌株的芽孢數(shù)量達到6.4×109個/mL，芽孢產(chǎn)率為97.61%。

3 小結(jié)與討論

本試驗通過比較B. subtilis ZX-29在不同條件下的芽孢產(chǎn)率，從而確定了該菌株搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)芽孢的最佳條件為：培養(yǎng)基成分：可溶性淀粉0.5%、蛋白胨2.0%、KH2PO4 0.10%和MnSO4·H2O 0.05%；培養(yǎng)條件：pH 8.0、種齡20 h、裝瓶量30 mL，培養(yǎng)溫度30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵時間48 h。優(yōu)化后的芽孢產(chǎn)率達到97.61%。最終生物量為6.4×109個/mL。河北農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程實驗室已經(jīng)對一些拮抗菌、益生菌等的產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化進行了多年研究，已達到了工業(yè)化生產(chǎn)的要求。并且通過多年研究可知，某些條件的刺激也有可能導(dǎo)致芽孢快速生成，比如突然降溫、靜置、添加固體介質(zhì)等，但本研究中未進行相關(guān)試驗，將在以后進行相關(guān)方面的研究，進一步完善試驗結(jié)果，以便更快、更好地進行工業(yè)化生產(chǎn)。

參考文獻：

[1] 吳華東，吳志青.植酸酶的特性及其在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].江西畜牧獸醫(yī)雜志，2011（5）：5-8.

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[10] 黃魁英，夏楓耿，黃樂天，等.耐高溫植酸酶畢赤酵母工程菌發(fā)酵中試條件優(yōu)化[J].現(xiàn)代食品科技，2011，21（10）：1238-1241.

[11] 沈莎莎，楊紅建，張曉明.瘤胃微生物植酸酶的分類與酶學(xué)性質(zhì)研究進展[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2011，42（12）：1655-1660.

[12] 于 平，陳益潤.響應(yīng)面法優(yōu)化芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶[J].中國糧油學(xué)報，2011，26（3）：86-90.

[13] 李術(shù)娜，王樹香，王占利，等.大麗輪枝菌拮抗細菌B. subtilis LZ2-70產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化[J].棉花學(xué)報，2009，21（4）：307-312.

[14] 程麗娟，薛泉宏，來航線.微生物學(xué)實驗技術(shù)[M].西安：世界圖書出版公司，2000.

[15] 沈 萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實驗[M].第三版.北京：高等教育出版社，1999.

2.3 無機鹽對B. subtilis ZX-29菌株發(fā)酵產(chǎn)芽孢的影響

從圖3可看出，不同的無機鹽種類對芽孢形成的影響差異較大。B. subtilis ZX-29在培養(yǎng)72 h時，KH2PO4試驗組中芽孢產(chǎn)率可達95.57%；銅鹽組中則既沒有菌體存在也無芽孢形成；MnSO4·H2O作為無機鹽時，其芽孢生成率也較高，可達到93.51%。試驗結(jié)果顯示KH2PO4為B. subtilis ZX-29菌株產(chǎn)芽孢的最佳無機鹽。但由于用KH2PO4做無機鹽時，雖然芽孢產(chǎn)率較高，但菌體的生長狀況欠佳，而以MnSO4·H2O作為無機鹽時，其芽孢產(chǎn)率較高，菌體生長狀況也較好，故B. subtilis ZX-29菌株培養(yǎng)基中的無機鹽采用KH2PO4和MnSO4·H2O的復(fù)合鹽為最佳。

2.4 B. subtilis ZX-29培養(yǎng)基成分優(yōu)化正交試驗結(jié)果

首先對B. subtilis ZX-29菌株不同培養(yǎng)時間進行芽孢計數(shù)，結(jié)果表明其發(fā)酵48 h時的芽孢產(chǎn)率達到90%以上，從而以發(fā)酵48 h的結(jié)果為代表進行正交分析。由表1可見，B. subtilis ZX-29菌株培養(yǎng)基最佳成分組成為：可溶性淀粉0.5%，蛋白胨2.0%，KH2PO4 0.10%和MnSO4·H2O 0.05%。

2.5 B. subtilis ZX-29培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果

以B. subtilis ZX-29菌株發(fā)酵48 h的結(jié)果為代表進行正交分析，B. subtilis ZX-29菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果見表2。由表2可見，B. subtilis ZX-29菌株最優(yōu)培養(yǎng)條件為：pH8.0、種齡20 h、裝瓶量30 mL。

2.6 B. subtilis ZX-29芽孢染色結(jié)果

按以上優(yōu)化條件對B. subtilis ZX-29菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，以血球計數(shù)板法測定其總生物量，并對所得芽孢進行孔雀綠染色和結(jié)晶紫染色觀察。觀察統(tǒng)計結(jié)果為：發(fā)酵液中B. subtilis ZX-29菌株的芽孢數(shù)量達到6.4×109個/mL，芽孢產(chǎn)率為97.61%。

3 小結(jié)與討論

本試驗通過比較B. subtilis ZX-29在不同條件下的芽孢產(chǎn)率，從而確定了該菌株搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)芽孢的最佳條件為：培養(yǎng)基成分：可溶性淀粉0.5%、蛋白胨2.0%、KH2PO4 0.10%和MnSO4·H2O 0.05%；培養(yǎng)條件：pH 8.0、種齡20 h、裝瓶量30 mL，培養(yǎng)溫度30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵時間48 h。優(yōu)化后的芽孢產(chǎn)率達到97.61%。最終生物量為6.4×109個/mL。河北農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程實驗室已經(jīng)對一些拮抗菌、益生菌等的產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化進行了多年研究，已達到了工業(yè)化生產(chǎn)的要求。并且通過多年研究可知，某些條件的刺激也有可能導(dǎo)致芽孢快速生成，比如突然降溫、靜置、添加固體介質(zhì)等，但本研究中未進行相關(guān)試驗，將在以后進行相關(guān)方面的研究，進一步完善試驗結(jié)果，以便更快、更好地進行工業(yè)化生產(chǎn)。

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[14] 程麗娟，薛泉宏，來航線.微生物學(xué)實驗技術(shù)[M].西安：世界圖書出版公司，2000.

[15] 沈 萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實驗[M].第三版.北京：高等教育出版社，1999.

2.3 無機鹽對B. subtilis ZX-29菌株發(fā)酵產(chǎn)芽孢的影響

從圖3可看出，不同的無機鹽種類對芽孢形成的影響差異較大。B. subtilis ZX-29在培養(yǎng)72 h時，KH2PO4試驗組中芽孢產(chǎn)率可達95.57%；銅鹽組中則既沒有菌體存在也無芽孢形成；MnSO4·H2O作為無機鹽時，其芽孢生成率也較高，可達到93.51%。試驗結(jié)果顯示KH2PO4為B. subtilis ZX-29菌株產(chǎn)芽孢的最佳無機鹽。但由于用KH2PO4做無機鹽時，雖然芽孢產(chǎn)率較高，但菌體的生長狀況欠佳，而以MnSO4·H2O作為無機鹽時，其芽孢產(chǎn)率較高，菌體生長狀況也較好，故B. subtilis ZX-29菌株培養(yǎng)基中的無機鹽采用KH2PO4和MnSO4·H2O的復(fù)合鹽為最佳。

2.4 B. subtilis ZX-29培養(yǎng)基成分優(yōu)化正交試驗結(jié)果

首先對B. subtilis ZX-29菌株不同培養(yǎng)時間進行芽孢計數(shù)，結(jié)果表明其發(fā)酵48 h時的芽孢產(chǎn)率達到90%以上，從而以發(fā)酵48 h的結(jié)果為代表進行正交分析。由表1可見，B. subtilis ZX-29菌株培養(yǎng)基最佳成分組成為：可溶性淀粉0.5%，蛋白胨2.0%，KH2PO4 0.10%和MnSO4·H2O 0.05%。

2.5 B. subtilis ZX-29培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果

以B. subtilis ZX-29菌株發(fā)酵48 h的結(jié)果為代表進行正交分析，B. subtilis ZX-29菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果見表2。由表2可見，B. subtilis ZX-29菌株最優(yōu)培養(yǎng)條件為：pH8.0、種齡20 h、裝瓶量30 mL。

2.6 B. subtilis ZX-29芽孢染色結(jié)果

按以上優(yōu)化條件對B. subtilis ZX-29菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，以血球計數(shù)板法測定其總生物量，并對所得芽孢進行孔雀綠染色和結(jié)晶紫染色觀察。觀察統(tǒng)計結(jié)果為：發(fā)酵液中B. subtilis ZX-29菌株的芽孢數(shù)量達到6.4×109個/mL，芽孢產(chǎn)率為97.61%。

3 小結(jié)與討論

本試驗通過比較B. subtilis ZX-29在不同條件下的芽孢產(chǎn)率，從而確定了該菌株搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)芽孢的最佳條件為：培養(yǎng)基成分：可溶性淀粉0.5%、蛋白胨2.0%、KH2PO4 0.10%和MnSO4·H2O 0.05%；培養(yǎng)條件：pH 8.0、種齡20 h、裝瓶量30 mL，培養(yǎng)溫度30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵時間48 h。優(yōu)化后的芽孢產(chǎn)率達到97.61%。最終生物量為6.4×109個/mL。河北農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程實驗室已經(jīng)對一些拮抗菌、益生菌等的產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化進行了多年研究，已達到了工業(yè)化生產(chǎn)的要求。并且通過多年研究可知，某些條件的刺激也有可能導(dǎo)致芽孢快速生成，比如突然降溫、靜置、添加固體介質(zhì)等，但本研究中未進行相關(guān)試驗，將在以后進行相關(guān)方面的研究，進一步完善試驗結(jié)果，以便更快、更好地進行工業(yè)化生產(chǎn)。

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