洋蔥假單胞菌產脂肪酶條件的優化

王旭愿+張敏+李成濤+沈穎輝+武晶

摘要：采用Rashid N p-nPP比色法，通過單因素試驗和正交試驗對洋蔥假單胞菌（Pseudomonas cepacia）產脂肪酶的培養基主要成分和發酵條件進行優化，以提高聚丁二酸丁二醇酯（PBS）的生物降解速率。結果表明，該菌種產脂肪酶的最適培養基為菜子油5.0 g/L，酵母膏0.5 g/L，乳化劑Tween-60 2.5 g/L，培養基初始pH 8.0；最適培養條件為接種量9%，培養溫度35 ℃，搖床轉速130 r/min，培養時間3 d。在此優化培養基條件下，洋蔥假單胞菌產脂肪酶活性可達32.935 U/mL。

關鍵詞：洋蔥假單胞菌（Pseudomonas cepacia）；聚丁二酸丁二醇酯（PBS）；脂肪酶；優化

中圖分類號：Q939.11+2；TQ925+.6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）01-0184-04

Optimization of Production Conditions of the Lipase from Pseudomonas cepacia

WANG Xu-yuan，ZHANG Min，LI Cheng-tao，SHEN Ying-hui，WU Jing

（Key Laboratory of Auxiliary Chemistry & Technology for Chemical Industry， Ministry of Education， Shaanxi University of Science & Technology， Xian 710021， China）

Abstract： The colorimetric method of Rashid N p-nPP was used， and single factor and orthogonal experiments were applied to optimize the fermentation medium and culture conditions of Pseudomonas cepacia， in order to improve the production of lipase to improve the biodegradation rate of poly（butylene succinate）（PBS）. The results showed that the optimum medium contained 5.0 g/L rapeseed oil， 0.5 g/L yeast extract， 2.5 g/L emulsifier Tween-60， with the initial pH 8.0. The optimum culture conditions were 9% inoculation， culture temperature 35 ℃， shake rotation 130 r/min and culturing length 3 days. Under the optimum conditions， the lipase from Pseudomonas cepacia could reach 32.935 U/mL.

Key words： Pseudomonas cepacia； poly butylenes succinate （PBS）； lipase； optimization

收稿日期：2013-05-10

基金項目：陜西科技大學創新科研團隊基金項目（TD10-01）；陜西科技大學研究生創新基金項目

作者簡介：王旭愿（1990-），女，陜西西安人，在讀碩士研究生，研究方向為微生物降解高分子材料，（電話）15309242538（電子信箱）

xuyuanguo15@163.com。

眾所周知，大多數的傳統塑料難以降解，且不易回收利用，其造成的環境污染引起了社會各界的廣泛關注[1，2]。因此，人們投入了大量的精力去研究開發可生物降解的環境友好型材料，聚丁二酸丁二醇酯（PBS）具有良好的生物降解性和力學性能，因而受到了極大的關注[3-6]。PBS廢棄后，在土壤微生物的作用下，可降解為低分子量物質，最終降解為對環境無污染的CO2和H2O[7]。在PBS的生物降解過程中，雖然其行為是由微生物主導，但直接起降解作用的是微生物代謝過程中所產生的脂肪酶，即在脂肪酶的作用下，PBS主鏈中的酯鍵發生水解斷裂進而發生降解[8]。因此，提高微生物代謝生產脂肪酶的能力對于促進PBS降解，提高PBS降解速度有著十分重要的作用。

本研究是從洋蔥假單胞菌出發，對1株代謝脂肪酶的菌株進行了培養基和發酵條件的優化，以提高其可降解PBS脂肪酶的代謝產量和活力，為后續微生物降解PBS基共聚物的研究提供了基礎數據。

1 材料與方法

1.1 菌種

試驗于2012年12月至2013年3月在陜西科技大學教育部輕化工助劑化學與技術重點實驗室進行。洋蔥假單胞菌（Pseudomonas cepacia）由本實驗室自主分離篩選并鑒定保存。

1.2 培養基

菌種保存培養基：牛肉膏 0.3 g、蛋白胨 0.5 g、NaCl 0.5 g、瓊脂2 g、蒸餾水100 mL、pH 7.0。

菌種活化培養基：牛肉膏 0.3 g、蛋白胨 0.5 g、NaCl 0.5 g、蒸餾水 100 mL、pH 7.0。

基礎發酵培養基：菜子油 1 g、（NH4）2SO4 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、KH2PO4 0.05 g、K2HPO4 0.05 g、蒸餾水 100 mL、pH 8.0。培養基于121 ℃下滅菌20 min備用。

將洋蔥假單胞菌菌種接種到斜面保存培養基上，于37 ℃培養箱中培養24 h，然后用接種環挑取菌體接于活化培養基中，置于35 ℃，130 r/min搖床上培養24 h后，按6%接種量接入基礎發酵培養基中，在250 mL錐形瓶中裝100 mL基礎發酵培養基，在同樣條件下培養48 h。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酶活性的測定 以酶活力為檢測指標，將培養48 h后的發酵液于3 000 r/min下冷凍離心分離12 min，除去菌體，取其上層清液即粗酶液，于4 ℃下保存備用。采用Rashid N p-nPP比色法[9]測定發酵液中脂肪酶的活性。在上述條件下，每分鐘水解產生1 μmol對硝基苯酚所需的酶量定義為1個酶活單位（U）。

1.3.2 洋蔥假單胞菌產酶條件的單因素試驗 從基礎發酵培養基出發，研究不同碳源、氮源、培養溫度、培養基初始pH、搖床轉速、接種量、乳化劑及乳化劑含量對洋蔥假單胞菌產脂肪酶的影響，并對其進行分析比較。

1.3.3 培養基優化正交試驗 根據單因素試驗結果，采用L9（34）正交試驗優化發酵培養基各組分，正交試驗設計因素和水平見表1。

1.3.4 發酵條件優化正交試驗 根據單因素試驗結果，選擇接種量、溫度、搖床轉速和培養時間這4個發酵影響因素，采用L9（34）正交試驗優化發酵條件，正交試驗設計因素和水平見表2。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 不同碳源對洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶活性的影響 假單胞菌能利用的碳源種類很多[10]，本試驗中選取了7種物質分別作為發酵培養基的惟一碳源。如圖1所示，洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的最適碳源為菜子油，以菜子油為碳源時洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的活性最高，并且在3組平行試驗中，脂肪酶活性相差不大，說明以菜子油為碳源時洋蔥假單胞菌產酶量及酶活性較高且相對穩定，所以確定采用菜子油作為發酵培養基的碳源。

2.1.2 不同氮源對洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶活性的影響 氮素對微生物的生長發育有著重要意義，微生物利用氮素在細胞內合成氨基酸和堿基，進而合成蛋白質、核酸等細胞成分[10]。從圖2可以看出，以酵母膏為氮源時，洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的活性最高，而其他7種物質作為氮源時，酶活性均低于酵母膏為氮源時的酶活性，所以采用酵母膏作為洋蔥假單胞菌發酵培養基的氮源。

2.1.3 不同培養溫度對洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶活性的影響 培養溫度的變化能夠影響微生物體內許多生化反應，從圖3中可以看出，洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的活性隨溫度的升高呈先增加后減小的趨勢，在培養溫度為35 ℃時脂肪酶活性達到最高。說明在培養溫度較低時，微生物生長緩慢，其新陳代謝作用所分泌的胞外脂肪酶量較小，而當培養溫度高于最適培養溫度時，微生物細胞功能急劇下降，易于衰老和死亡。

2.1.4 不同培養基初始pH對洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶活性的影響 環境的酸堿度與微生物的代謝生長和產酶關系密切，pH影響微生物原生質膜所帶電荷的極性和滲透性等。由圖4可知，洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的活性隨pH的增大呈先增加后減小的趨勢，且在培養基pH為8.5時活性達到最高。由此可知，洋蔥假單胞菌代謝的脂肪酶為堿性脂肪酶，這與國內外報道相符[11，12]。

2.1.5 不同搖床轉速對洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶活性的影響 搖床轉速的大小直接關系到發酵液溶氧量的多少，氧含量是影響微生物生長的因素之一，不同的微生物對氧的需求量不同。如圖 5所示，洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的活性在搖床轉速為140 r/min時活性最高，并且在3次平行試驗中，脂肪酶活性相差不大，故其最適搖床轉速為140 r/min。隨著搖床轉速的增大，洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的活性呈先增加后減小的趨勢。說明轉速過低時，通氣量小，影響菌體的生長繁殖，營養物質難以被有效利用，而當轉速過高時，通氣量又太大，生長繁殖過快，菌體易過早進入死亡期，產生的脂肪酶較少，因此脂肪酶活性差。

2.1.6 不同接種量對洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶活性的影響 接種量和培養物生長過程的延緩期長短呈反比[13]，一般工業上會采用較大的接種量來縮短延緩期。增加接種量，實際上是利用生物的一種群體效應，即通過種內的相互關系（如種內互助），使之更快地適應新環境，縮短生長過程的延緩期，從而縮短發酵周期。如圖6所示，隨著發酵瓶中接種量的增大，洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的活性呈先增加后減小的趨勢。洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的活性在接種量為9%時最高。在接種量較小時，微生物發酵周期較長，脂肪酶的產率較低；當接種量高于最適接種量時，菌絲密集，空間與資源相對匱乏，營養物質不能滿足菌體的生長需要，導致菌體代謝過程受阻，從而不利于微生物發酵產酶。

2.1.7 不同乳化劑對洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶活性的影響 乳化劑即表面活性劑，可以改善微生物細胞膜的通透性，使脂肪酶易于分泌到細胞外[11]，因此合適的乳化劑可提高生物的產酶量。從圖7中可以看出，不同乳化劑對洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的影響不同。向洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的培養體系中分別添加Tween-60、Tween-80、明膠、Trinton X-100、阿拉伯膠、橄欖油乳化劑及Tween-60與Span-80按質量比1∶1復配而成的乳化劑時，可以不同程度地使脂肪酶活性增加且更加穩定，其中Tween-60對其促進作用最大。添加Span-80和十二烷基磺酸鈉時，對脂肪酶則表現為抑制作用。

2.1.8 乳化劑含量對洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶活性的影響 在發酵培養基中添加不同濃度的非離子表面活性劑Tween-60來提高細胞膜的通透性，如圖8所示，在一定范圍內添加乳化劑Tween-60，脂肪酶活性比未添加的對照有較大的提高。當添加量低于0.30%時，脂肪酶活性隨添加量質量分數的增加而提高，在0.30%時達到最大；當繼續加大Tween-60用量時，脂肪酶活性開始出現下降，這可能是大劑量的Tween-60對菌體產生了一定的毒害，影響微生物的正常代謝活動及產酶。

2.2 正交試驗結果

2.2.1 基礎發酵培養基主要成分正交試驗結果 根據單因素試驗結果，選擇菜子油為碳源，酵母膏為氮源，Tween-60為乳化劑，培養基正交試驗優化結果見表3。通過直觀分析可知，影響洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的因素從大到小依次是A、C、B、D，即作為碳源的菜籽油對洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的活性影響最大，其次是乳化劑，培養基初始pH影響最小，最優組合為A1B1C1D1，即菜子油5.0 g/L，酵母膏0.5 g/L，乳化劑Tween-60 2.5 g/L，培養基初始pH 8.0。

2.2.2 發酵條件正交試驗結果 發酵條件正交試驗結果見表4。通過直觀分析可知，影響洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶活性的因素從大到小依次是H、E、G、F，即培養時間對脂肪酶活性影響最大，接種量次之，培養溫度對酶活性的影響最小，所以選擇脂肪酶活性最高的培養條件為接種量9%，培養溫度35 ℃，搖床轉速130 r/min，培養時間3 d，即E2F2G1H1。

3 小結

以洋蔥假單胞菌為出發菌株，通過單因素和正交試驗，得到洋蔥假單胞菌生產脂肪酶的最優培養基組成為菜子油5.0 g/L、酵母膏0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、K2HPO4 0.5 g/L、乳化劑Tween-60 2.5 g/L，pH 8.0。最佳培養條件為接種量9%、培養溫度35 ℃、搖床轉速130 r/min，發酵培養3 d。在此條件下，脂肪酶活性可達32.935 U/mL。同時，從發酵條件正交試驗結果可以看出，適當延長培養時間對脂肪酶活力影響不大，但培養時間過長則會導致部分菌體絲自溶，培養基變黏稠，不利于脂肪酶的產生。

參考文獻：

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[13] 王順成，劉幽燕，李青云，等.產堿桿菌DN25的氰降解代謝途徑分析與產酶條件優化[J].化工學報，2011，62（2）：482-489.

（責任編輯 趙 娟）

2.2 正交試驗結果

2.2.1 基礎發酵培養基主要成分正交試驗結果 根據單因素試驗結果，選擇菜子油為碳源，酵母膏為氮源，Tween-60為乳化劑，培養基正交試驗優化結果見表3。通過直觀分析可知，影響洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的因素從大到小依次是A、C、B、D，即作為碳源的菜籽油對洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的活性影響最大，其次是乳化劑，培養基初始pH影響最小，最優組合為A1B1C1D1，即菜子油5.0 g/L，酵母膏0.5 g/L，乳化劑Tween-60 2.5 g/L，培養基初始pH 8.0。

2.2.2 發酵條件正交試驗結果 發酵條件正交試驗結果見表4。通過直觀分析可知，影響洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶活性的因素從大到小依次是H、E、G、F，即培養時間對脂肪酶活性影響最大，接種量次之，培養溫度對酶活性的影響最小，所以選擇脂肪酶活性最高的培養條件為接種量9%，培養溫度35 ℃，搖床轉速130 r/min，培養時間3 d，即E2F2G1H1。

3 小結

以洋蔥假單胞菌為出發菌株，通過單因素和正交試驗，得到洋蔥假單胞菌生產脂肪酶的最優培養基組成為菜子油5.0 g/L、酵母膏0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、K2HPO4 0.5 g/L、乳化劑Tween-60 2.5 g/L，pH 8.0。最佳培養條件為接種量9%、培養溫度35 ℃、搖床轉速130 r/min，發酵培養3 d。在此條件下，脂肪酶活性可達32.935 U/mL。同時，從發酵條件正交試驗結果可以看出，適當延長培養時間對脂肪酶活力影響不大，但培養時間過長則會導致部分菌體絲自溶，培養基變黏稠，不利于脂肪酶的產生。

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（責任編輯 趙 娟）

2.2 正交試驗結果

2.2.1 基礎發酵培養基主要成分正交試驗結果 根據單因素試驗結果，選擇菜子油為碳源，酵母膏為氮源，Tween-60為乳化劑，培養基正交試驗優化結果見表3。通過直觀分析可知，影響洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的因素從大到小依次是A、C、B、D，即作為碳源的菜籽油對洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶的活性影響最大，其次是乳化劑，培養基初始pH影響最小，最優組合為A1B1C1D1，即菜子油5.0 g/L，酵母膏0.5 g/L，乳化劑Tween-60 2.5 g/L，培養基初始pH 8.0。

2.2.2 發酵條件正交試驗結果 發酵條件正交試驗結果見表4。通過直觀分析可知，影響洋蔥假單胞菌代謝脂肪酶活性的因素從大到小依次是H、E、G、F，即培養時間對脂肪酶活性影響最大，接種量次之，培養溫度對酶活性的影響最小，所以選擇脂肪酶活性最高的培養條件為接種量9%，培養溫度35 ℃，搖床轉速130 r/min，培養時間3 d，即E2F2G1H1。

3 小結

以洋蔥假單胞菌為出發菌株，通過單因素和正交試驗，得到洋蔥假單胞菌生產脂肪酶的最優培養基組成為菜子油5.0 g/L、酵母膏0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、K2HPO4 0.5 g/L、乳化劑Tween-60 2.5 g/L，pH 8.0。最佳培養條件為接種量9%、培養溫度35 ℃、搖床轉速130 r/min，發酵培養3 d。在此條件下，脂肪酶活性可達32.935 U/mL。同時，從發酵條件正交試驗結果可以看出，適當延長培養時間對脂肪酶活力影響不大，但培養時間過長則會導致部分菌體絲自溶，培養基變黏稠，不利于脂肪酶的產生。

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[11] 汪小鋒.洋蔥假單胞菌（Pseudomonas cepacia）PCL-3產脂肪酶條件優化及純化工藝研究[D].武漢：華中科技大學，2008.

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[13] 王順成，劉幽燕，李青云，等.產堿桿菌DN25的氰降解代謝途徑分析與產酶條件優化[J].化工學報，2011，62（2）：482-489.

（責任編輯 趙 娟）