骨關節(jié)結核各類標本進行結核分枝桿菌培養(yǎng)與PCR檢測的陽性率結果分析

董偉杰 秦世炳 趙立平 付育紅 黃海榮

骨關節(jié)結核是除結核性胸膜炎和淋巴結核外最常見的肺外結核，約占結核病患者的1%～3%[1]。臨床上骨關節(jié)結核的診斷是一個難點，患者從首次出現(xiàn)癥狀到最后確診往往需要幾個月甚至幾年的時間。近年來，隨著磁共振成像(MRI)技術[2]的推廣使用，使得骨關節(jié)結核診斷所需時間大大縮短。雖然結核病的細菌學診斷是最直接可靠的證據(jù)，然而骨關節(jié)結核卻往往由于標本的不易獲得和培養(yǎng)陽性率低等原因，在骨關節(jié)結核的診斷中沒能發(fā)揮重要作用。為了解標本的性質和培養(yǎng)方法對培養(yǎng)陽性率的影響，筆者觀察了骨關節(jié)結核病灶中膿液、肉芽、死骨及干酪壞死組織的BACTEC MGIT 960(簡稱“MGIT 960”)培養(yǎng)及改良羅氏培養(yǎng)的培養(yǎng)陽性率，以期為將來骨關節(jié)結核標本的留取和培養(yǎng)方式的選擇提供依據(jù)，提高骨關節(jié)結核的細菌學診斷水平。

對象和方法

一、研究對象

選取2011年6月至2012年5月北京胸科醫(yī)院收治的術前通過CT及MRI發(fā)現(xiàn)存在膿腫及死骨，后經病理檢查明確診斷為骨關節(jié)結核的全部患者50例，其中男26例，女24例；年齡范圍為15～84歲，平均(40.7±19.6)歲；60歲以上老年患者9例(18.0%)；根據(jù)患病部位分為脊柱結核40例，關節(jié)結核8例，胸骨關節(jié)結核2例。所有患者均接受病灶清除手術，術中取得病灶中的膿液、干酪、肉芽及死骨組織，分別進行結核分枝桿菌MGIT 960 培養(yǎng)及改良羅氏培養(yǎng)，另外對所有的膿液標本開展了結核分枝桿菌PCR檢測。本研究標本為常規(guī)送檢標本中的剩余標本，已通過北京結核病胸部腫瘤研究所倫理委員會審核。

50例患者通過病灶清除術共分離出膿液標本50份、干酪標本42份、肉芽標本48份及死骨組織標本43份，其中有37位患者同時獲取了全部4種類型的標本。

二、實驗方法

1.標本處理：膿液標本依照《結核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[3]中的N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)-氫氧化鈉法進行標本處理。干酪、肉芽及死骨組織在加入適量磷酸鹽緩沖液后，應用微型研磨器Fastprep-24(美國MP Biomeidcals公司)進行勻漿，之后直接接種。

2.羅氏培養(yǎng)：接種后的改良羅氏培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)，每周檢查一次細菌的生長狀態(tài)直至有菌落生長為止。以結核分枝桿菌標準株H37Rv作為陽性對照，以空白管作為陰性對照。

3. MGIT 960培養(yǎng)：接種后的MGIT 960培養(yǎng)管放入MGIT 960全自動細菌培養(yǎng)系統(tǒng)(美國BD公司)中進行培養(yǎng)，以結核分枝桿菌標準株H37Rv作為陽性對照，以空白管作為陰性對照。

4.結核分枝桿菌PCR檢測：采用達安基因公司生產的結核分枝桿菌PCR檢測試劑盒，陽性對照、陰性對照設置及其他具體操作見產品說明。

三、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用百分率表示。

結 果

所有標本的改良羅氏培養(yǎng)結果，MGIT 960培養(yǎng)結果及PCR檢測結果見表1。依據(jù)MGIT 960培養(yǎng)陽性率排列4種標本順序為：死骨組織(41.9%，18/43)>膿液(40.0%，20/50)>肉芽(33.3%，16/48)=干酪(33.3%，14/42)；依據(jù)羅氏培養(yǎng)陽性率排列4種標本順序為：肉芽(20.8%，10/48)>膿液(20.0%，10/50)>死骨組織(16.3%，7/43)>干酪(14.3%，6/42)。以50例患者所取的4種標本中1種標本或以上培養(yǎng)陽性評價兩種培養(yǎng)方法，則MGIT 960 培養(yǎng)陽性率為42.0%(21/50)，羅氏培養(yǎng)陽性率為30.0%(15/50)；兩種培養(yǎng)方法的聯(lián)合陽性率為 50.0%(25/50)。

50份膿液標本單獨進行了PCR檢測，其中有24份PCR檢測陽性，陽性率為48.0%(24/50)。24份PCR檢測陽性的膿液標本中有18份培養(yǎng)也獲得陽性結果，另有6份標本培養(yǎng)陰性。PCR檢測、MGIT 960及改良羅氏培養(yǎng)3種方法的聯(lián)合陽性率為68.0%(34/50)。

表1 膿液、干酪、肉芽及死骨組織的MGIT 960、羅氏培養(yǎng)及PCR陽性情況

討 論

骨關節(jié)結核的診斷目前可以依賴的手段包括影像學檢測、病理學檢測和病原微生物學檢測。由于長期以來骨關節(jié)結核患者的結核分枝桿菌培養(yǎng)陽性率較低[4]，臨床上主要依賴影像學檢查進行診斷，依靠術后病理檢查進行最后確診，而作為結核病診斷最為直接可靠的細菌學檢查技術常得不到臨床醫(yī)生的重視。為了探討如何提高骨關節(jié)結核患者獲得細菌學診斷的比例，筆者開展了此項研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，通過選取骨關節(jié)結核病灶中的膿液、肉芽組織、死骨及干酪壞死組織等多種標本，聯(lián)合使用BACTEC MGIT 960培養(yǎng)和改良羅氏培養(yǎng)可以獲得50.0%的培養(yǎng)陽性率。這一陽性率遠高于吳啟秋等[5]報道的應用BACTEC TB460檢測儀選取膿液、干酪壞死組織及肉芽組織進行培養(yǎng)獲得的18.4%的培養(yǎng)陽性率。進一步分析發(fā)現(xiàn)，除了增加羅氏培養(yǎng)小幅度提升了培養(yǎng)陽性率外，標本的處理方式對于陽性率提高有非常重要的作用。本研究中分離到的死骨組織的MGIT 960培養(yǎng)陽性率高于膿液及肉芽組織，這一結果出乎試驗設計之初的預期。本試驗中，筆者將死骨組織經微型研磨器打碎離心處理后進行常規(guī)培養(yǎng)，獲得的MGIT 960培養(yǎng)陽性率為41.9%(18/43)，高于骨關節(jié)結核患者最常留取的膿液標本的培養(yǎng)陽性率(40.0%，20/40)。由此表明，未來臨床醫(yī)生在骨關節(jié)結核手術中，應該盡量留取多種標本并根據(jù)標本選取恰當?shù)臉吮咎幚矸绞剑蕴岣吆罄m(xù)培養(yǎng)的陽性率。

本研究中，4種類型標本MGIT 960培養(yǎng)的陽性率都較相應的羅氏培養(yǎng)陽性率高，提高程度從12.5%到25.6%不等，表明MGIT 960培養(yǎng)比羅氏培養(yǎng)更適用于骨關節(jié)結核患者的標本培養(yǎng)。然而對于所納入的50例患者，有4例患者僅羅氏培養(yǎng)獲得陽性結果，由此表明在條件允許的時候同時開展兩種培養(yǎng)有利于提高總體陽性率。對所有的膿液標本進行PCR檢測，再聯(lián)合改良羅氏培養(yǎng)及MGIT 960培養(yǎng)可使本組標本的總體陽性率達到68.0%。這從一個側面提示，骨關節(jié)結核病灶中的病變組織若得以妥善分離利用，并綜合利用目前成熟的微生物學培養(yǎng)方法及分子生物學技術將對骨關節(jié)結核的診斷大有裨益，對縮短診斷時間亦有積極意義。目前，對于早期骨關節(jié)結核的診斷，通常采用病變部位穿刺的辦法獲得標本，但在脊柱結核，由于解剖位置深，往往獲得的組織量微小[6]，除常規(guī)送檢病理外，如何通過分子生物學技術對穿刺標本進行處理，以獲得微生物學診斷依據(jù)，亦不失為日后努力的方向。

骨關節(jié)結核獲得細菌學證據(jù)不僅有利于確診，而且還為后續(xù)的細菌學研究提供了條件。以本研究為例，筆者對10株羅氏培養(yǎng)陽性的菌株開展了后續(xù)的藥敏試驗，其中5株被確定為耐藥菌株，而其中又有3株為耐多藥菌株。鑒于骨關節(jié)結核患者在手術之后仍然需要進行抗結核化療，而早期獲得患者耐藥及藥敏結果，并給予合理的抗結核治療并結合合理的手術方法是治愈的關鍵[7]，因此獲得藥敏試驗結果對于指導化療方案的選擇意義重大，而提高骨關節(jié)結核的陽性培養(yǎng)率是開展傳統(tǒng)藥敏試驗的前提。

傳統(tǒng)的培養(yǎng)和藥敏試驗有些耗時過長，影響了其對臨床的指導價值。新興的一些分子生物學技術如GeneXpert[8-9]尤以其能夠進行快速藥敏診斷而深受臨床歡迎。本研究至少提示未來開展新的分子診斷技術時，可以恰當?shù)剡x擇術中取得的組織來進行有效檢測，以早期獲得藥敏試驗結果，以便及時發(fā)現(xiàn)耐藥患者，調整治療方案，以減少術后并發(fā)癥的發(fā)生。

總之，本研究的結果表明，對于骨關節(jié)結核患者，除了留取常規(guī)的膿液標本外，應盡可能選擇多種標本以提高培養(yǎng)陽性率。MGIT 960培養(yǎng)可以作為首選的細菌學診斷方法，但如果再聯(lián)合使用改良羅氏培養(yǎng)和PCR擴增技術，能夠進一步提高檢出陽性率。

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[6] 大會學術委員會. 骨關節(jié)結核診療共識(討論稿).結核病與肺部健康雜志，2012，1(3)：206-212.

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