高灌藍(lán)莓CBF基因的單核苷酸多態(tài)性分析

魏海蓉等

摘要：本研究以21個(gè)高灌藍(lán)莓品種為試材，克隆VcCBF基因，測(cè)序后分析其單核苷酸多態(tài)性（SNP），共克隆到123個(gè)非重復(fù)序列，發(fā)現(xiàn)120個(gè)SNP位點(diǎn)，單核苷酸多態(tài)性發(fā)生頻率為1/695bp，核苷酸多態(tài)性值（Pi）為0.01251。在120個(gè)SNP位點(diǎn)中，單態(tài)突變位點(diǎn)62個(gè)；簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)58個(gè)，其中雙突變55個(gè)，三突變3個(gè)。對(duì)其堿基替換方式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)換91個(gè)，顛換26個(gè)，轉(zhuǎn)換與顛換的發(fā)生比率為3.5∶1。通過單倍型分析發(fā)現(xiàn)，21個(gè)藍(lán)莓品種的VcCBF基因存在5種單倍型。

關(guān)鍵詞：CBF；單核苷酸多態(tài)性（SNP）；藍(lán)莓

中圖分類號(hào)：Q524+.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2014）02-0008-03

CBF基因（也稱為DREB1基因）編碼一個(gè)具有AP2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄激活子，能夠結(jié)合到CRT（C-repeat）或DRE（dehydration-responsive element）順式作用元件上，調(diào)節(jié)植物冷適應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)[1]。CBF基因是植物冷適應(yīng)及信號(hào)傳導(dǎo)領(lǐng)域最有意義的發(fā)現(xiàn)之一，多種與植物冷適應(yīng)相關(guān)的基因都受其調(diào)控，目前已在多種重要的農(nóng)作物及蔬菜中發(fā)現(xiàn)該基因[2～4]。Polashock等[5]從高灌藍(lán)莓（Vaccinium corymbosum）品種藍(lán)豐（Bluecrop）和兔眼藍(lán)莓（Vaccinium virgatum） 品種梯芙藍(lán)（Tifblue）中克隆到CBF基因并驗(yàn)證其功能，發(fā)現(xiàn)CBF基因表達(dá)量和表達(dá)模式的差異可能與品種間的抗寒性不同有關(guān)。

單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）是指在基因組水平上由單核苷酸變異引起的一種序列多態(tài)性[6]。在所有可能的DNA序列差異性中，單核苷酸多態(tài)性是發(fā)生頻率最高的變異，人類90%左右的DNA序列多態(tài)性都是單核苷酸多態(tài)性[7]。單核苷酸多態(tài)性具有數(shù)量大、分布廣、穩(wěn)定性強(qiáng)、易于分型等優(yōu)點(diǎn)，在人類疾病的診斷及治療、致病基因的發(fā)現(xiàn)、族群的演化研究等方面起到了重要作用，同時(shí)在小麥、玉米、大豆等作物的物理作圖、進(jìn)化研究、遺傳研究中也是有效的分子標(biāo)記[6， 8～11]。

本研究以21個(gè)不同品種的高灌藍(lán)莓為材料，克隆VcCBF基因，采用直接測(cè)序法篩查其單核苷酸多態(tài)性，以期為研究VcCBF基因與藍(lán)莓抗寒性的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本研究所用的21個(gè)高灌藍(lán)莓品種采自山東省果樹研究所藍(lán)莓品種資源圃，分別為伯克利（Berkeley）、喜來（Sierra）、陶柔（Toro）、都克（Duke）、日出（Sunrise）、藍(lán)豐（Bluecrop）、埃利奧特（Elliott）、達(dá)柔（Darrow）、藍(lán)塔（Bluetta）、澤西（Jersey）、布里吉塔（Brigitta）、早藍(lán)（Earliblue）、晚藍(lán)（Lateblue）、藍(lán)金（Bluegold）、瑞卡（Reka）、佐治亞寶石（Georgiagem）、密斯提（Misty）、奧尼爾（ONeal）、夏普藍(lán)（Sharpblue）、羅衛(wèi)（Reveille）和普魯（Puru）。

1.2VcCBF基因的克隆、測(cè)序及單核苷酸多態(tài)性分析

以藍(lán)莓幼嫩葉片為材料，采用TIANGEN植物基因組提取試劑盒提取基因組DNA， 根據(jù)已發(fā)表的藍(lán)莓CBF基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 擴(kuò)增所用上游引物為5′-GAATCGTCGATGGAATATAACT-3′，下游引物為5′-TCTAAAATCTAACTCCACAACG-3′。PCR產(chǎn)物回收后采用pMD18-T載體（TaKaRa公司）連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有Amp的LB平板上培養(yǎng)過夜后，挑取菌落進(jìn)行菌落PCR篩選陽性克隆，每個(gè)品種選取8個(gè)，送上海生工生物工程有限公司測(cè)序[12]，所得序列采用DnaSP v5軟件分析[13]。

2結(jié)果與分析

2.1VcCBF基因的克隆

PCR所得目的片段長(zhǎng)度為698 bp，編碼區(qū)長(zhǎng)681 bp，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，除去重復(fù)序列，共得到123個(gè)非重復(fù)序列，每個(gè)品種有4～8個(gè)，結(jié)果見表1。

2.2VcCBF基因的單核苷酸多態(tài)性分析

將得到的123個(gè)VcCBF基因編碼區(qū)非重復(fù)序列用DnaSP v5軟件進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性分析，結(jié)果見表2。共發(fā)現(xiàn)了120個(gè)SNP位點(diǎn)，全部為單核苷酸替換，沒有InDel的情況發(fā)生，SNP的發(fā)生頻率為1/695bp，核苷酸多態(tài)性值（Pi）為0.01251。在120個(gè)SNP位點(diǎn)中，單態(tài)突變位點(diǎn)（singleton variable sites）62個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)（parsimony informative sites）58個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)中，雙突變55個(gè)，三突變3個(gè)（表3）。

3討論與結(jié)論

本研究通過對(duì)21個(gè)藍(lán)莓品種VcCBF基因的克隆測(cè)序，得到123個(gè)非重復(fù)序列，測(cè)序總長(zhǎng)度83 394 bp，在VcCBF基因編碼區(qū)共發(fā)現(xiàn)120個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，單核苷酸多態(tài)性發(fā)生頻率為1/695bp，核苷酸多態(tài)性值（Pi）為0.01251。相對(duì)于其他物種，VcCBF基因的單核苷酸多態(tài)性頻率較低，這可能與其受到的選擇壓力較大相關(guān)。通過對(duì)120個(gè)SNP位點(diǎn)的具體分析，發(fā)現(xiàn)單態(tài)突變位點(diǎn)有62個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)58個(gè)（雙突變55個(gè)，三突變3個(gè)）。對(duì)堿基替換方式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)換有91個(gè)，顛換為26個(gè)，轉(zhuǎn)換與顛換的比率為3.5∶1。進(jìn)一步通過組裝一致序列，進(jìn)行單倍型分析，發(fā)現(xiàn)21個(gè)藍(lán)莓品種中有5種單倍型。

直接測(cè)序法篩查SNP也存在不足，首先在克隆和測(cè)序過程中會(huì)造成假陽性，在檢測(cè)到的62個(gè)單態(tài)突變位點(diǎn)中可能存在克隆或測(cè)序錯(cuò)誤造成的誤差。此外，高灌藍(lán)莓品種為四倍體，且多為雜交選育而來，其本身VcCBF基因的情況較為復(fù)雜，本研究從每個(gè)品種篩選8個(gè)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，可能沒有涵蓋所有的內(nèi)源VcCBF基因，從而對(duì)分析其單核苷酸多態(tài)性和單倍型造成不足。本研究對(duì)高灌藍(lán)莓CBF基因進(jìn)行了初步分析，找到了部分VcCBF基因的單倍型，但每種單倍型對(duì)高灌藍(lán)莓抗寒性的貢獻(xiàn)還需進(jìn)一步研究。

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