牛腸道病毒RT—PCR檢測方法的建立及初步應用

劉曉等

摘要：參照GenBank中登錄的牛腸道病毒（BEV）全基因組序列，針對其3D基因設計合成了1對特異性引物，提取病毒RNA，逆轉錄為cDNA，進行PCR擴增，經條件優(yōu)化，建立了BEV的RT-PCR檢測方法，并對該方法的特異性、敏感性進行驗證。結果顯示，該方法從分離的牛腸道病毒中擴增出了732 bp的特異性目的片段；且對牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、牛輪狀病毒（BRV）、牛冠狀病毒（BCoV）等相關病毒均無交叉反應；其檢出敏感度達10-1TCID50。應用該方法對山東地區(qū)84份臨床疑似發(fā)病牛樣品進行檢測，21份為陽性，陽性檢出率為25%。

關鍵詞：牛腸道病毒；3D基因；RT-PCR；檢測

中圖分類號：S852.65+3文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）02-0013-04

牛腸道病毒（Bovine enterovirus， BEV）屬于小RNA病毒科、腸道病毒屬，呈球形，大小為25～30 nm，是無囊膜單股正鏈RNA病毒[1]。自1959年Moll和Davis[2]首次分離到BEV以來，很多國家和地區(qū)先后報道了牛腸道病毒的感染情況[3～5]。腸道病毒是脊椎動物腸道中原有的棲居者，可以從患腸道疾病、肺炎、呼吸系統(tǒng)疾病和生殖障礙疾病的牛分泌物或排泄物中分離獲得，也可以從正常牛的糞便樣品中分離，還存在于牛糞便污染的環(huán)境或水體中，常作為糞便污染指示劑[6]。

據(jù)研究報道，牛腸道病毒在國外牛群中的陽性率約為17.6%～80%[7]，而在我國，有關此病的病原學及流行病學調查的報道很少。近年來，山東省周邊某些牛場發(fā)生了以水樣和血便等嚴重腹瀉為特征的疾病，致使奶牛的食欲和產奶量大幅下降。本研究結合本實驗室分離獲得的牛腸道病毒基因和GenBank登錄的牛腸道病毒全基因組序列，針對其3D基因的相對保守區(qū)域，設計1對特異性引物，建立了牛腸道病毒的RT-PCR檢測方法，并初步應用于臨床送檢樣本的檢測，具有較好的敏感性和特異性，為國內牛腸道病毒的臨床檢測及流行病學監(jiān)測提供了有力支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1毒株和樣品來源病料樣品為山東省某牛場發(fā)生腹瀉癥狀的病牛糞便。BVDV Oregon C24V 病毒株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；牛腸道病毒（BEV）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）、牛輪狀病毒（BRV）、牛冠狀病毒（BcoV）、MDBK正常細胞等均由山東省農業(yè)科學院奶牛研究中心保存。臨床組織樣品來自牛場送檢的疑似發(fā)病樣品，共84份，主要包括血液、糞便、淋巴結、腸等。

1.1.2主要試劑生理鹽水、青霉素、鏈霉素購自Hyclone公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit、TransScript Ⅱ First-Strand cDNA Synthesis SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司；rTaq DNA 聚合酶、dNTP、RNA酶抑制劑、DNA Marker DL2000購自寶生物工程（大連） 有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1引物的設計與合成根據(jù)GenBank已登錄的BEV K2577株（AF123432）、SL305株（AF123433）、VG-5-27株（NC_001859）等毒株的全序列，分析BEV 3D基因的保守區(qū)，設計引物BEVF：5′GAGCCCAGTGTTTTCTTTGATGTTTTC3′和BEVR： 5′AAAGTTGATCAATAAAGTGCTTGCA3′，擴增片段大小為732 bp。引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成，稀釋成20 μmol/L，-20℃保存。

1.2.2病料處理將病料按1∶5加入滅菌生理鹽水研磨，經反復凍融后，按每毫升加入青霉素、鏈霉素各1 000單位，以3 000 r/min離心20 min，取上清液用于試驗或-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3病毒RNA的提取取200 μl病料處理液，按EasyPure Viral DNA/RNA Kit說明書進行操作。

1.2.4反轉錄合成cDNA將提取的RNA按照 TransScript Ⅱ First-Strand cDNA Synthesis SuperMix說明書進行反轉錄合成cDNA。

1.2.5RT-PCR檢測方法的建立以反轉錄獲得的cDNA為模板進行PCR擴增，對PCR 反應體系（模板、酶、引物、鎂離子、dNTPs的濃度）、反應條件（變性、退火、延伸的溫度及循環(huán)次數(shù)）進行調整優(yōu)化，確定最佳PCR反應條件。

1.2.6RT-PCR 特異性試驗應用建立的RT-PCR方法分別對BEV、BVDV、IBRV、BCoV、BRV、MDBK正常細胞進行檢測，驗證該檢測方法的特異性。

1.2.7病毒的培養(yǎng)選擇細胞形態(tài)良好的MDBK單層細胞，棄去營養(yǎng)液后用PBS清洗細胞。按照1%的細胞培養(yǎng)量接種病料處理液，于37℃感作1 h，棄去感作液，加入維持液（2%新生馬血清的DMEM），于5%CO2、37℃培養(yǎng)，12 h觀察細胞病變，培養(yǎng)24 h后收毒。細胞培養(yǎng)毒反復凍融3次后再次接種易感細胞，如此傳3代，收獲的細胞毒用于其他試驗[8]。以未接毒的MDBK細胞為對照。

1.2.8RT-PCR敏感性試驗將BEV RNA進行10倍梯度稀釋后，分別取10 μl進行反轉錄，然后進行PCR擴增，驗證該檢測方法的敏感性。

1.2.9臨床樣本的檢測應用優(yōu)化建立的牛腸道病毒RT-PCR檢測方法對山東地區(qū)84份臨床疑似發(fā)病牛樣品進行檢測，將檢出的陽性樣本RT-PCR擴增產物分別送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序，進一步驗證該方法的特異性。

2結果與分析

2.1RT-PCR擴增及鑒定

對臨床發(fā)生嚴重腹瀉的病牛糞便樣本處理后，提取病毒RNA，逆轉錄為cDNA，進行PCR擴增。經優(yōu)化，建立了最佳的PCR反應體系： 10×PCR Buffer（MgCl2 Plus） 3 μl，dNTP Mixture（2.5 mmol/L） 4 μl，BEV-F （20 μmol/L） 0.5 μl，BEV-R（20 μmol/L） 0.5 μl，rTaq （5 U/μl） 0.25 μl，cDNA 2 μl，RNA/DNA-Free Water 19.75 μl，總體積30 μl；PCR最佳反應條件為94℃ 30 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，31個循環(huán)。

利用該體系擴增獲得了約732 bp的目的片段（圖1），與預期相符。將PCR擴增產物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序，測序結果進行BLAST比對分析。結果表明，擴增片段與GenBank中收錄的BEV VG-5-27株部分3D基因的同源性達82%。

3討論

牛腸道病毒（BEV）可以導致牛發(fā)生多種綜合征，為及時減輕該病毒對奶牛生產性能的影響，建立快速、有效的檢測方法是非常有必要的。目前已報道的BEV檢測技術主要有電鏡檢查、病毒分離、血清學試驗和TaqMan熒光定量PCR等，這些方法存在使用的儀器設備昂貴，試驗周期長，耗費人力、物力等缺點[9～11]，因此，迫切需要建立一種快速、敏感、特異的檢測方法來解決生產實際中的問題。

近年隨著PCR診斷技術的建立及廣泛應用，許多研究者已經將PCR技術應用于多種病毒性疾病的檢測，并且取得了一定的成績[12]。腸道病毒基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，本研究建立的RT-PCR檢測方法主要基于3D基因的相對保守序列設計引物，用該方法檢測BEV，可以檢測出10-1TCID50的BEV樣品，敏感性高于病毒分離法；同時具有良好的特異性，檢測BVDV、IBRV、BRV、BCoV、MDBK細胞等均為陰性；且病毒樣品RNA的提取、反轉錄到PCR擴增以及電泳檢測，全部過程用時較短，可方便快捷地診斷出BEV感染，適合大規(guī)模推廣應用。

利用該RT-PCR方法對山東省送檢的84份臨床疑似發(fā)病牛樣品進行檢測，共檢出21份陽性，陽性檢出率為25%，表明牛腸道病毒感染在我國部分地區(qū)的牛群中普遍存在，且危害相當嚴重。隨機選取4個陽性樣品進行測序，結果也證實為BEV，進一步表明該方法具有較高的敏感性和特異性。該RT-PCR方法不僅可用于BEV的實驗室檢測或診斷，還可用于BEV的流行病學調查及監(jiān)測等，為BEV的防控奠定了基礎。

參考文獻：

[1]Knipe D M， Howley P M. Fields Virology[M].5th Edition.Philadelphia：Lippincott Williams & Wilkins， 2007：1649-1724.

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[8]侯佩莉，王洪梅，楊盛華， 等.牛腸道病毒山東分離株的分離鑒定及序列分析[C].中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第八屆全國會員代表大會暨第十五次學術研討會論文集. 2013：1027-1030.

[9]吳丹，吳濤，張鶴曉， 等.牛腸道病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J].中國預防獸醫(yī)學報，2012， 11（34）：903-906.

[10]Zhang A Q， Smith J R， Burgess G W. A capture antibody ELISA for detection of antibodies against bovine enterovirus [J].J.Virol.Methods，1989，12（1-2）：223-226.

[11]Jimenez-Clavero M A， Escribano-Romero E， Mansilla C， et al. Survey of bovine enterovirus in biological and environmental samples by a highly sensitive real-time reverse transcription-PCR[J]. Appl. Environ. Microbiol.， 2005， 71（7）：3536-3543.

[12]Beld M， Minnaar R， Weel J， et al. Highly sensitive assay for detection of enterovirus in clinical specimens by reverse transcription-PCR with an armored RNA internal control[J]. J. Clin. Microbiol.， 2004，42（7）：3059-3064.

對臨床發(fā)生嚴重腹瀉的病牛糞便樣本處理后，提取病毒RNA，逆轉錄為cDNA，進行PCR擴增。經優(yōu)化，建立了最佳的PCR反應體系： 10×PCR Buffer（MgCl2 Plus） 3 μl，dNTP Mixture（2.5 mmol/L） 4 μl，BEV-F （20 μmol/L） 0.5 μl，BEV-R（20 μmol/L） 0.5 μl，rTaq （5 U/μl） 0.25 μl，cDNA 2 μl，RNA/DNA-Free Water 19.75 μl，總體積30 μl；PCR最佳反應條件為94℃ 30 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，31個循環(huán)。

利用該體系擴增獲得了約732 bp的目的片段（圖1），與預期相符。將PCR擴增產物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序，測序結果進行BLAST比對分析。結果表明，擴增片段與GenBank中收錄的BEV VG-5-27株部分3D基因的同源性達82%。

3討論

牛腸道病毒（BEV）可以導致牛發(fā)生多種綜合征，為及時減輕該病毒對奶牛生產性能的影響，建立快速、有效的檢測方法是非常有必要的。目前已報道的BEV檢測技術主要有電鏡檢查、病毒分離、血清學試驗和TaqMan熒光定量PCR等，這些方法存在使用的儀器設備昂貴，試驗周期長，耗費人力、物力等缺點[9～11]，因此，迫切需要建立一種快速、敏感、特異的檢測方法來解決生產實際中的問題。

近年隨著PCR診斷技術的建立及廣泛應用，許多研究者已經將PCR技術應用于多種病毒性疾病的檢測，并且取得了一定的成績[12]。腸道病毒基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，本研究建立的RT-PCR檢測方法主要基于3D基因的相對保守序列設計引物，用該方法檢測BEV，可以檢測出10-1TCID50的BEV樣品，敏感性高于病毒分離法；同時具有良好的特異性，檢測BVDV、IBRV、BRV、BCoV、MDBK細胞等均為陰性；且病毒樣品RNA的提取、反轉錄到PCR擴增以及電泳檢測，全部過程用時較短，可方便快捷地診斷出BEV感染，適合大規(guī)模推廣應用。

利用該RT-PCR方法對山東省送檢的84份臨床疑似發(fā)病牛樣品進行檢測，共檢出21份陽性，陽性檢出率為25%，表明牛腸道病毒感染在我國部分地區(qū)的牛群中普遍存在，且危害相當嚴重。隨機選取4個陽性樣品進行測序，結果也證實為BEV，進一步表明該方法具有較高的敏感性和特異性。該RT-PCR方法不僅可用于BEV的實驗室檢測或診斷，還可用于BEV的流行病學調查及監(jiān)測等，為BEV的防控奠定了基礎。

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對臨床發(fā)生嚴重腹瀉的病牛糞便樣本處理后，提取病毒RNA，逆轉錄為cDNA，進行PCR擴增。經優(yōu)化，建立了最佳的PCR反應體系： 10×PCR Buffer（MgCl2 Plus） 3 μl，dNTP Mixture（2.5 mmol/L） 4 μl，BEV-F （20 μmol/L） 0.5 μl，BEV-R（20 μmol/L） 0.5 μl，rTaq （5 U/μl） 0.25 μl，cDNA 2 μl，RNA/DNA-Free Water 19.75 μl，總體積30 μl；PCR最佳反應條件為94℃ 30 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，31個循環(huán)。

利用該體系擴增獲得了約732 bp的目的片段（圖1），與預期相符。將PCR擴增產物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序，測序結果進行BLAST比對分析。結果表明，擴增片段與GenBank中收錄的BEV VG-5-27株部分3D基因的同源性達82%。

3討論

牛腸道病毒（BEV）可以導致牛發(fā)生多種綜合征，為及時減輕該病毒對奶牛生產性能的影響，建立快速、有效的檢測方法是非常有必要的。目前已報道的BEV檢測技術主要有電鏡檢查、病毒分離、血清學試驗和TaqMan熒光定量PCR等，這些方法存在使用的儀器設備昂貴，試驗周期長，耗費人力、物力等缺點[9～11]，因此，迫切需要建立一種快速、敏感、特異的檢測方法來解決生產實際中的問題。

近年隨著PCR診斷技術的建立及廣泛應用，許多研究者已經將PCR技術應用于多種病毒性疾病的檢測，并且取得了一定的成績[12]。腸道病毒基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，本研究建立的RT-PCR檢測方法主要基于3D基因的相對保守序列設計引物，用該方法檢測BEV，可以檢測出10-1TCID50的BEV樣品，敏感性高于病毒分離法；同時具有良好的特異性，檢測BVDV、IBRV、BRV、BCoV、MDBK細胞等均為陰性；且病毒樣品RNA的提取、反轉錄到PCR擴增以及電泳檢測，全部過程用時較短，可方便快捷地診斷出BEV感染，適合大規(guī)模推廣應用。

利用該RT-PCR方法對山東省送檢的84份臨床疑似發(fā)病牛樣品進行檢測，共檢出21份陽性，陽性檢出率為25%，表明牛腸道病毒感染在我國部分地區(qū)的牛群中普遍存在，且危害相當嚴重。隨機選取4個陽性樣品進行測序，結果也證實為BEV，進一步表明該方法具有較高的敏感性和特異性。該RT-PCR方法不僅可用于BEV的實驗室檢測或診斷，還可用于BEV的流行病學調查及監(jiān)測等，為BEV的防控奠定了基礎。

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[8]侯佩莉，王洪梅，楊盛華， 等.牛腸道病毒山東分離株的分離鑒定及序列分析[C].中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第八屆全國會員代表大會暨第十五次學術研討會論文集. 2013：1027-1030.

[9]吳丹，吳濤，張鶴曉， 等.牛腸道病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J].中國預防獸醫(yī)學報，2012， 11（34）：903-906.

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[12]Beld M， Minnaar R， Weel J， et al. Highly sensitive assay for detection of enterovirus in clinical specimens by reverse transcription-PCR with an armored RNA internal control[J]. J. Clin. Microbiol.， 2004，42（7）：3059-3064.