羽毛降解菌的分離及多樣性分析

賈嘉元等

摘要：從禽肉加工廠的污泥中分離到174株能在牛奶瓊脂平板產透明圈微生物菌株，其中42株具有分解羽毛的能力，從中篩選出13株具有較強羽毛降解能力的菌株，均能在48 h內將羽毛完全分解。16S rDNA的BLAST比對及系統發育樹分析結果顯示，8株菌為寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas），1株菌為芽孢桿菌屬（Bacillus），4株菌為氣單胞菌屬（Aeromonas）。

關鍵詞：羽毛降解菌；16S rDNA；發育樹

中圖分類號：Q939.9文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）02-0068-04

羽毛是養殖業的廢棄物，但同時又是一種很好的飼料蛋白原料和化工資源。我國每年的羽毛總量超過100萬噸[1]，而且隨著集約化養殖的快速發展，產量逐年增加。羽毛主要成分是角蛋白質，其半胱氨酸形成高度交聯的二硫鍵，難以被普通蛋白水解酶分解，如果不經過處理動物很難消化和利用[2]。常規處理羽毛的方式為酸堿水解或高溫高壓蒸煮，耗能高而且易引起嚴重環境污染。自然界中的某些微生物能分泌角蛋白酶將角蛋白質緩慢分解，因此篩選具有高效分解羽毛能力的微生物一直是該領域研究的基礎工作。自然環境中降解角蛋白的微生物普遍存在，包括真菌、細菌和放線菌等[2～5]。近年來，隨著人們對羽毛類廢棄物資源循環利用價值認識的深入，越來越多的羽毛分解菌被分離純化培養，從而為羽毛分解機制研究及其開發利用提供越來越豐富的微生物資源。但未見典型環境條件下降解羽毛微生物多樣性及優勢種群的報道。

本研究從家禽屠宰廠污泥池典型環境取樣，篩選分離具有羽毛降解能力的微生物菌株，通過16S rDNA的BLAST比對及系統發育樹進行微生物多樣性分析，為研究羽毛降解機理和微生物資源開發利用提供理論基礎。

1材料與方法

1.1樣品及菌株分離

樣品采集于山東六和平度屠宰廠污泥沉淀池。取5 g污泥樣品，加到裝有95 ml滅菌水和玻璃珠的三角瓶中，180 r/min振蕩30 min，做成懸液；將上清液梯度稀釋，100 μl涂布牛奶平板，30℃ 倒置培養36 h；挑取水解圈比較大的菌落點接牛奶固體平板；挑取牛奶平板上水解圈較大的菌落接種到含有羽毛粉液體培養基的三角瓶中，180 r/min、30℃搖床培養，篩選能降解羽毛粉的菌株。將具有分解羽毛粉能力的菌株接種到含有完整羽毛的三角瓶中（培養條件同上）進一步篩選，觀察羽毛降解情況。牛奶瓊脂培養基和羽毛粉液體培養基的配制參見黃亦鈞等（2009）[6]的方法。

1.2菌株、質粒和材料

細菌和質粒見表1。E. coli菌株于LB培養基37℃培養。安芐青霉素終濃度為100 μg/ml。T-載體、Taq酶和T4 DNA連接酶均購自大連TaKaRa公司；DNA Marker、Pfu酶和DNA回收試劑盒均購自北京全式金公司。

3結論與討論

本研究從家禽屠宰廠污泥沉淀池這一典型環境中分離到174株產蛋白酶的菌株，利用羽毛培養進一步篩選，得到42株具有羽毛分解能力的菌株，說明了特定環境下功能微生物的聚落（cluster）特點。對其中分解羽毛能力強的13株菌進行16S rDNA序列分析，BLAST比對結果表明，8株（61.5%）屬于寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas），4株屬于氣單胞菌屬（Aeromonas），1株屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），說明該環境中分解羽毛的微生物存在一定程度的多樣性及優勢種群。

系統發育樹分析發現，SDK02、SDK03、SDK04、SDK05、SDK06、SDK07、SDK08、SDK09與嗜麥芽寡養單胞菌親緣關系最近。嗜麥芽寡養單胞菌屬于革蘭氏陰性原核微生物，是一類條件致病菌[10]，已有關于該菌具有分解羽毛能力及角蛋白酶基因克隆的報道[11，12]；而且S. maltophilia 能分解有毒化合物和高分子的多環芳香烴[13，14]，也是潛在的生物殺蟲劑和環境修復微生物資源。菌株SDK12與枯草芽孢桿菌親緣關系最近，可歸為枯草芽孢桿菌。枯草芽孢桿菌屬于應用廣泛的益生菌，其降解羽毛的機理和發酵代謝均有報道[1，15，16]。菌株SDK01、SDK10、SDK11、SDK13為殺鮭氣單胞菌，目前尚未見該類菌具有降解羽毛功能的研究報道，是一類新的有待研究與開發的微生物資源。

致謝：黃亦鈞博士、許麗紅碩士為本研究做了部分實驗工作，在此表示感謝。

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