一株雞源嗜鉛乳酸菌的篩選鑒定

姜彥君等

摘要：試驗(yàn)?zāi)康氖菑娜怆u的腸道內(nèi)容物及排泄物中篩選出具有鉛抗性的細(xì)菌，用于重金屬鉛的去除。采用涂布平板技術(shù)從采集的樣品中共分離篩選到8株具有較好鉛抗性和吸附性的菌株，其中JT1菌株對(duì)鉛的抗性（800 mg/L）和去除能力 （66.95%）最高。通過培養(yǎng)特征、形態(tài)觀察、生理生化鑒定、16S rDNA序列分析等方法證明，所得JT1菌株為屎腸球菌（Enterococcus faecium）。該菌株可以在10～45℃、pH 4.5～9.6、6.5%NaCl溶液、0.8%膽鹽、0.1%胰蛋白酶濃度條件下生長(zhǎng)良好。

關(guān)鍵詞：雞；重金屬；鉛；乳酸菌

中圖分類號(hào)：Q939.92文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2014）02-0072-06

由于人為因素（農(nóng)業(yè)、工業(yè)及軍事作業(yè)）影響，重金屬對(duì)環(huán)境的污染越來越嚴(yán)重，近幾年已逐步成為全球問題。重金屬是生物體非必需元素，對(duì)植物、動(dòng)物都具有毒性。由于重金屬的非生物降解性和永久存在性，很容易在土壤、植物以及水生植物和動(dòng)物中積累，從而導(dǎo)致其濃度在食物鏈中不斷放大[1]。

在有害重金屬中，鉛（Pb）和鎘（Cd）是最主要的污染物，可以引起多種生物有機(jī)體的功能障礙，通過食物鏈進(jìn)入人體后，可引起各種疾病，例如鎘會(huì)引起骨軟化、肺癌、腎癌、心血管系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)紊亂[2]，鉛會(huì)損壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)、降低記憶力、影響兒童的智力發(fā)育和骨骼生長(zhǎng)[3]。

研究顯示，已有利用大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌等細(xì)菌和真菌清除水體環(huán)境中重金屬的報(bào)道，且效果顯著[4]。迄今尚未見從環(huán)境及動(dòng)物體內(nèi)分離篩選具有重金屬抗性乳酸菌的報(bào)道。本試驗(yàn)從肉雞腸道中分離和鑒定出具有鉛抗性的細(xì)菌，并對(duì)其16S rDNA序列進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步將其作為金屬清除益生菌添加到動(dòng)物飼料或食品中奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料和儀器

培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，乙酸鈉5 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，磷酸氫二鉀2 g，葡萄糖20 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，檸檬酸二銨2 g，吐溫-80 1 ml，蒸餾水1 000 ml，pH 5.4～5.6，115℃滅菌30 min；MRS固體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基中加入1.4%瓊脂；改良MRS固體培養(yǎng)基：MRS固體培養(yǎng)基中加入5%碳酸鈣；LB肉湯；營(yíng)養(yǎng)瓊脂。

試劑：乙酸鉛（AR）；碳酸鈣；Tris；EDTA；十二烷基硫酸鈉；NaCl；酚/氯仿/異戊醇：（25∶24∶1）。

儀器： 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海市精宏 DHG-9036A；高壓蒸汽滅菌鍋：鳥取三洋電機(jī)（廣州）有限公司； 精密pH計(jì)：德國(guó)賽多利斯股份公司；水浴恒溫振蕩器：金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；電子分析天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司；原子吸收分光光度計(jì)；高速冷凍離心機(jī)；PCR儀；電泳儀；凝膠成像設(shè)備。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1樣品的采集于2011年從山東省日照市果莊肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)及青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地?zé)o菌采集糞便樣品。菌株篩選試驗(yàn)在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品風(fēng)險(xiǎn)分析實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，以MRS固體培養(yǎng)基作為分離培養(yǎng)基。

1.2.2耐性菌株的馴化、篩選稱取5.0 g新鮮樣品，在無(wú)菌條件下將其放入裝有適量玻璃珠和45 ml無(wú)菌生理鹽水的錐形瓶中，37℃、140 r/min 振蕩30 min后稀釋至10-3、10-4、10-5，各吸取0.1 ml分別涂布于含有100、200、400、800 mg/L Pb2+的MRS固體平板上，37℃培養(yǎng)，于24、48 h時(shí)觀察平板上細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況[5]。將篩選出的耐鉛菌株逐步在含更高鉛濃度的培養(yǎng)基上接種培養(yǎng)，從而獲得目的菌株。將獲得的優(yōu)勢(shì)耐鉛菌株在含200 mg/L Pb2+的培養(yǎng)基上分離純化，最終獲得單一菌株并保存（甘油管保存法）。

1.2.3菌株穩(wěn)定性的測(cè)定將獲得的優(yōu)勢(shì)菌株在含200 mg/L Pb2+的MRS固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代多次，觀察其對(duì)鉛的耐受性是否發(fā)生變化，從而判斷其穩(wěn)定性[6]。

1.2.4耐性菌株的吸附鉛試驗(yàn)將獲得的優(yōu)勢(shì)菌株離心后的濕菌體加入10 ml含20 mg/L Pb2+的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩吸附后，12 000 r/min離心5 min，取上清液定容至50 ml，測(cè)定Pb2+的濃度，重復(fù)3次。以加大腸桿菌為對(duì)照，以不加菌為空白對(duì)照。

1.2.8JT1菌株生長(zhǎng)特性研究

①生長(zhǎng)曲線的測(cè)定：將活化好的JT1菌株按1%的接種量接入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)，每隔4 h取樣一次，用分光光度計(jì)測(cè)定菌液的OD600值，用未接種的MRS液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，測(cè)定的相應(yīng)OD600值為縱坐標(biāo)，繪制菌株的生長(zhǎng)曲線[10]。

②酸耐受試驗(yàn)：將活化好的JT1菌株按1%接種量分別接種于pH值3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、9.5的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h測(cè)定OD600，以pH值為橫坐標(biāo)，測(cè)定的相應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)，繪制曲線。

③膽鹽耐受試驗(yàn)：取活化后JT1的菌株0.1 ml分別接種于含0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)后，進(jìn)行涂布，觀察生長(zhǎng)狀況[11]。

④消化酶耐受試驗(yàn)：按1%接種量接種于含0.1%（W/V）胰蛋白酶的MRS液體培養(yǎng)基中，以不添加胰蛋白酶的MRS培養(yǎng)基為對(duì)照，37℃培養(yǎng)，0、8 h時(shí)各取樣一次，稀釋適當(dāng)倍數(shù)進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。

⑤抑菌性試驗(yàn)：選擇大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌作為測(cè)試菌株，分別取100 μl菌液涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，用直徑為7 mm的無(wú)菌圓形濾低在JT1菌株發(fā)酵液中充分浸泡，等距離擺放于平板上，37℃倒置培養(yǎng)24 h，量取抑菌圈直徑大小，測(cè)定菌株的抑菌性。endprint

2結(jié)果與分析

2.1耐性菌株的馴化、篩選及穩(wěn)定性測(cè)定

在含不同鉛濃度的MRS固體培養(yǎng)基中對(duì)樣品進(jìn)行篩選，獲得耐鉛能力較強(qiáng)的菌株，再將耐鉛菌株在相同鉛濃度的培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化，最終得到8株優(yōu)勢(shì)耐鉛菌株JT1～JT8，其中JT1耐鉛濃度最高，達(dá)800 mg/L。經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)后，該8株菌株的耐鉛性表現(xiàn)穩(wěn)定，未發(fā)生顯著變化，說明經(jīng)過多次傳代后沒有基因丟失，具有較高的、穩(wěn)定的重金屬耐受性。

2.2耐性菌株吸附鉛試驗(yàn)

不加菌的空白對(duì)照鉛的測(cè)定值為4.000 mg/ml，JT1～JT8菌株處理后鉛的測(cè)定值及吸附率見表2。由表2可以看出，與大腸桿菌相比，篩選馴化出的菌株對(duì)Pb2+具有一定的吸附效率，其中JT1吸附效率最高，為66.95%，具有一定的研究?jī)r(jià)值。

2.3JT1菌株P(guān)b2+吸附的影響因素

2.3.1pH值由圖1可知，在一定Pb2+濃度的溶液中，pH值較低時(shí)，JT1菌體對(duì)Pb2+吸附率較低，但隨著pH值的升高，吸附率也升高，當(dāng)pH值上升到6.5時(shí)，吸附率達(dá)到56.663%，pH值繼續(xù)升高，吸附率基本保持穩(wěn)定。因此，JT1菌株吸附重金屬鉛時(shí)的最佳pH值為6.5。

3討論

通過形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA序列測(cè)定[14]，鑒定本試驗(yàn)所篩選的雞源耐鉛細(xì)菌JT1為E. faecium。重金屬抗性、去除能力、抑菌性等特性顯示，E. faecium JT1菌株可耐受800 mg/L Pb2+，體外鉛吸附率達(dá)66.95%，同時(shí)可以抑制大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，因此可以作為益生菌添加到飼料中，用以去除動(dòng)物體內(nèi)的重金屬，控制重金屬在動(dòng)物體內(nèi)的長(zhǎng)期積累[15]，保障動(dòng)物性食品的安全，從而確保人類的安全[16]。其具體吸附機(jī)理及體內(nèi)吸附性能還需進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)：

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[13]趙嬌， 趙蕾. 一株促生拮抗木霉菌的鑒定[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 45（4）： 86-89.

[14]李方正，唐亮，趙建文，等. 一株高效秸稈纖維素降解真菌的分離、鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 7： 5-8.

[15]葛龍，李波.屎腸球菌在飼用微生態(tài)制劑中的研究與應(yīng)用[J].飼料與畜牧， 2013，6：57-59.

[16]Marcussen H， Holm P E， Dalsgaard A. Food safety aspects of toxic element accumulation in fish from wastewaterfed ponds in Hanoi[J]. Trop. Med. Int. Health， 2007， 12（2）：34-39.endprint

2結(jié)果與分析

2.1耐性菌株的馴化、篩選及穩(wěn)定性測(cè)定

在含不同鉛濃度的MRS固體培養(yǎng)基中對(duì)樣品進(jìn)行篩選，獲得耐鉛能力較強(qiáng)的菌株，再將耐鉛菌株在相同鉛濃度的培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化，最終得到8株優(yōu)勢(shì)耐鉛菌株JT1～JT8，其中JT1耐鉛濃度最高，達(dá)800 mg/L。經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)后，該8株菌株的耐鉛性表現(xiàn)穩(wěn)定，未發(fā)生顯著變化，說明經(jīng)過多次傳代后沒有基因丟失，具有較高的、穩(wěn)定的重金屬耐受性。

2.2耐性菌株吸附鉛試驗(yàn)

不加菌的空白對(duì)照鉛的測(cè)定值為4.000 mg/ml，JT1～JT8菌株處理后鉛的測(cè)定值及吸附率見表2。由表2可以看出，與大腸桿菌相比，篩選馴化出的菌株對(duì)Pb2+具有一定的吸附效率，其中JT1吸附效率最高，為66.95%，具有一定的研究?jī)r(jià)值。

2.3JT1菌株P(guān)b2+吸附的影響因素

2.3.1pH值由圖1可知，在一定Pb2+濃度的溶液中，pH值較低時(shí)，JT1菌體對(duì)Pb2+吸附率較低，但隨著pH值的升高，吸附率也升高，當(dāng)pH值上升到6.5時(shí)，吸附率達(dá)到56.663%，pH值繼續(xù)升高，吸附率基本保持穩(wěn)定。因此，JT1菌株吸附重金屬鉛時(shí)的最佳pH值為6.5。

3討論

通過形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA序列測(cè)定[14]，鑒定本試驗(yàn)所篩選的雞源耐鉛細(xì)菌JT1為E. faecium。重金屬抗性、去除能力、抑菌性等特性顯示，E. faecium JT1菌株可耐受800 mg/L Pb2+，體外鉛吸附率達(dá)66.95%，同時(shí)可以抑制大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，因此可以作為益生菌添加到飼料中，用以去除動(dòng)物體內(nèi)的重金屬，控制重金屬在動(dòng)物體內(nèi)的長(zhǎng)期積累[15]，保障動(dòng)物性食品的安全，從而確保人類的安全[16]。其具體吸附機(jī)理及體內(nèi)吸附性能還需進(jìn)一步的研究。

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[16]Marcussen H， Holm P E， Dalsgaard A. Food safety aspects of toxic element accumulation in fish from wastewaterfed ponds in Hanoi[J]. Trop. Med. Int. Health， 2007， 12（2）：34-39.endprint

2結(jié)果與分析

2.1耐性菌株的馴化、篩選及穩(wěn)定性測(cè)定

在含不同鉛濃度的MRS固體培養(yǎng)基中對(duì)樣品進(jìn)行篩選，獲得耐鉛能力較強(qiáng)的菌株，再將耐鉛菌株在相同鉛濃度的培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化，最終得到8株優(yōu)勢(shì)耐鉛菌株JT1～JT8，其中JT1耐鉛濃度最高，達(dá)800 mg/L。經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)后，該8株菌株的耐鉛性表現(xiàn)穩(wěn)定，未發(fā)生顯著變化，說明經(jīng)過多次傳代后沒有基因丟失，具有較高的、穩(wěn)定的重金屬耐受性。

2.2耐性菌株吸附鉛試驗(yàn)

不加菌的空白對(duì)照鉛的測(cè)定值為4.000 mg/ml，JT1～JT8菌株處理后鉛的測(cè)定值及吸附率見表2。由表2可以看出，與大腸桿菌相比，篩選馴化出的菌株對(duì)Pb2+具有一定的吸附效率，其中JT1吸附效率最高，為66.95%，具有一定的研究?jī)r(jià)值。

2.3JT1菌株P(guān)b2+吸附的影響因素

2.3.1pH值由圖1可知，在一定Pb2+濃度的溶液中，pH值較低時(shí)，JT1菌體對(duì)Pb2+吸附率較低，但隨著pH值的升高，吸附率也升高，當(dāng)pH值上升到6.5時(shí)，吸附率達(dá)到56.663%，pH值繼續(xù)升高，吸附率基本保持穩(wěn)定。因此，JT1菌株吸附重金屬鉛時(shí)的最佳pH值為6.5。

3討論

通過形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA序列測(cè)定[14]，鑒定本試驗(yàn)所篩選的雞源耐鉛細(xì)菌JT1為E. faecium。重金屬抗性、去除能力、抑菌性等特性顯示，E. faecium JT1菌株可耐受800 mg/L Pb2+，體外鉛吸附率達(dá)66.95%，同時(shí)可以抑制大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，因此可以作為益生菌添加到飼料中，用以去除動(dòng)物體內(nèi)的重金屬，控制重金屬在動(dòng)物體內(nèi)的長(zhǎng)期積累[15]，保障動(dòng)物性食品的安全，從而確保人類的安全[16]。其具體吸附機(jī)理及體內(nèi)吸附性能還需進(jìn)一步的研究。

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