水痘帶狀皰疹病毒基因亞型的研究進展

屈園園(綜述)，普雄明(審校)

(新疆維吾爾自治區人民醫院皮膚性病科，烏魯木齊 830001)

水痘帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)屬人類皰疹病毒α亞科，又稱人類皰疹病毒3型(human herpes virus typs 3，HHV-3),是水痘和帶狀皰疹的病原體。Boot等[1]利用水痘病毒Oka株(Oka parent,pOka)成功研制出水痘減毒活疫苗(Oka vaccine,vOka)，預防接種可顯著減少兒童水痘的發生率。疫苗接種者仍可發生水痘樣皮疹，接種的病毒疫苗也可潛伏體內而引發帶狀皰疹[2]。疫苗接種后發生的水痘或帶狀皰疹既可為VZV野生株感染引起，也可為pOka或vOka感染引起[3]。區分由野生病毒或偶爾有疫苗病毒引起的感染，對于基因型與地理分布、疫苗質量及接種效果評價等具有重要意義。VZV只有一個血清型，但不同毒株間基因序列仍有一定的差異。利用VZV毒株間基因序列差異可進行基因分型，而VZV毒株的基因分型研究對VZV感染的流行病學研究等具有重要意義。

1 VZV基因組結構

1986年Davison等[4]用雙脫氧核苷酸技術測序獲得了VZV Dumas株的全基因組序列。以后的研究又獲得了不同的VZV株(如VZV Oka疫苗株)、VZV-MSP、VZV-BC、VZV-CA123等基因組序列[5-7]。VZV基因組為線性雙鏈DNA分子，長約124 884 bp，由共價連接的長片段(L)和短片段(S)組成。長片段(UL)長約10 500 bp，兩端有小片段反向重復序列(TRL和IRL)，短片段(US)長約5232 bp，兩端有大片段反向重復序列(TRS和IRS)。因此，VZV基因組的結構模式為TRL-UL-IRL-IRS-US-TRS。

VZV基因組由71個開放讀碼框(open reading frame,ORF)組成，約編碼69種蛋白，其中ORF42和ORF45接合轉錄、翻譯成一種蛋白產物。另外，ORF62、ORF63、ORF64在TRS和IRS區分別重復一次即形成ORF71、ORF70、ORF69，因此VZV基因組實際包含69個獨特基因[8]。VZV基因組中還包含5個富含鳥嘌呤和胞嘧啶的串聯重復序列(R1-R5)。不同分離株R區串聯重復單位拷貝數存在差異，所以R區亦稱R可變區。R1、R2、R3區分別位于ORF11、ORF14、ORF22的基因編碼區，R4區位于IRS和TRS兩個區，分別在ORF62與ORF63之間和ORF70與ORF71之間；R5位于ORF60和ORF61之間。

2 VZV基因組變異

雖然VZV基因組具有較好的遺傳穩定性，但不同毒株間基因組仍存在變異，VZV毒株間基因變異可達500個堿基，且多位于R1-R5及病毒復制起點Oris[9]。不同毒株間基因變異主要表現為單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)。通過選擇不同的SNP位點及其組合進行分析，可將不同國家或地區的VZV分離株分為不同的基因型。

3 VZV基因分型技術

常用于VZV基因分型的技術包括限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphic,RFLP)和聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)-RFLP分析、實時PCR、核酸測序分析、系統進化樹分析、異源雙鏈泳動法、寡聚核苷酸微陣列分析、二分檢索等。

3.1RFLP和PCR-RFLP分析 RFLP最早用于證實VZV為引起水痘和帶狀皰疹的病原體，并用于區分VZV野生株和疫苗株，也為VZV基因的高度保守性提供了依據。常用于VZV基因分型的酶切位點包括ORF6中AluⅠ(SNP5745)、ORF21中Sau96Ⅰ(SNP33646)、ORF38中PstⅠ(SNP69349)、ORF54中BglⅠ(SNP95241)、ORF62中SmaⅠ(SNP106262)、NaeⅠ(SNP107252)和BssHⅡ(SNP107136),其中PstⅠ、BglⅠ、SmaⅠ最為常見[10]。PstⅠ酶切位點為大部分野生株共有，BglⅠ和SmaⅠ酶切位點為Oka株獨有。在北美和歐洲，絕大多數VZV病毒株在ORF38中(SNP69349)都含有Pst Ⅰ 酶切位點(PstⅠ+)，在ORF54中(SNP95241)不含Bgl Ⅰ 酶切位點(BglⅠ-)，但在日本有30%的病毒株為PstⅠ-，隨后PstⅠ-在美國夏威夷和澳大利亞也相繼被發現[7,11]。我國在內的其他亞洲國家也可能存在類似情況，故ORF38中的PstⅠ位點不適用于區分日本流行的野毒株和疫苗株[12]。SmaⅠ、NaeⅠ、BssHⅡ酶切位點位于ORF62，為疫苗株獨有，借助ORF62 PCR產物的酶切圖譜即可鑒別vOka和pOka[11,13]。RFLP方法簡便，但要求DNA量大、純度高、且酶切圖譜分辨率差?，F多與PCR相結合(PCR-RFLP)，即先用PCR擴增包含待測位點的DNA片段后用限制性內切酶酶切，根據PCR產物的酶切圖譜進行基因分析。PCR-RFLP操作簡單，費用低廉，適用于大樣本分析，但只能檢測已知突變，因而多用于區分野生株和疫苗株。如待測樣本同時含有野生株和疫苗株，酶切后可能出現復雜條帶而影響判斷。PCR-RFLP需要多種限制性內切酶，如病毒基因變異不在限制性內切酶的切點范圍，或使用的內切酶數量不夠，也可造成漏檢或分型不準確。

3.2實時熒光定量PCR 用Light-Cycler實時PCR檢測VZV陽性標本ORF62中SNP106262和ORF38中SNP69649，結果與PCR-RFLP分析結果一致，兩者均可用于鑒別VZV疫苗株和野生株[14]。與 PCR-RFLP相比，實時PCR無需酶切位點存在，操作更簡單、快速、雜交探針特異性更強，而且PCR擴增和產物熒光檢測均在閉管狀態下進行，可避免擴增產物污染所致假陽性。

3.3核酸測序 目前已完成全基因組測序的VZV共有23株，均可在基因庫獲得其全基因組序列[15]。對編碼VZV的一些糖蛋白和ORF62的DNA序列分析，已作為一種新的分析技術用于VZV基因分型。Faga等[16]對10株VZV的5種糖蛋白(gH/ORF37、gI/ORF67、gL/ORF60、gB/ORF31和gE/ORF68)以及ORF62基因的全序列進行分析，得出A,B,C,D四個基因型。核算測序最近被改進并應用于新加坡和泰國的VZV株分析[17]。核酸序列分析用于VZV基因分型最精確，但技術要求高、費用高，需反復比較分析才能得出結論，難以用于大規模檢測。

3.4系統進化樹分析 在已有VZV基因組序列基礎上，利用系統進化樹分析即可對VZV進行基因分型。Loparev等[11]運用系統進化分析結合其他分析技術對來自不同人群的大量臨床樣本進行了VZV多態性和多樣性分析，得到E,J,M三個主要基因型。系統進化樹分析還可用于驗證其他基因分型方法的準確性，其發展得益于大規模測序和分析技術的完善，但它只能在擁有大量序列信息的基礎上去做回顧性分析。

3.5異源雙鏈泳動法 異源雙鏈泳動法是在PCR反應體系中，使用同一對引物擴增不同來源的DNA片段后，形成相同大小的同源和異源雙鏈DNA。異源雙鏈DNA的泳動速度與其雙鏈同源性呈正比，同源性越高則泳動越快。通過比較待測樣品與VZV亞型的異源雙鏈DNA泳動率可對VZV進行基因分型。Barrett-Muir等[18]應用異源雙鏈泳動法技術對ORF1、ORF21、ORF50、ORF54中的SNP位點，對VZV英國分離株進行分析時，得到VZV4個主要基因型，分別為A型(非洲、亞洲)、J型(日本)、B型和C型(歐洲)。異源雙鏈泳動法技術作為一種快速、簡便、特異和經濟的VZV基因分型法，可用于大樣本毒株的基因分型，準確性比核酸測序法略差，但兩者結果仍高度一致。

3.6寡核苷酸微陣列分析 寡核苷酸微陣列分析又稱基因芯片法,是將大量特定寡核苷酸片段作為基因分型探針高密度而有序地固定于特制載玻片上，與熒光標記的待測核酸樣品雜交后，通過激光共聚焦系統檢測雜交信號強度，經計算機分析處理獲取樣品雜交信號的數量和序列信息，從而對核酸序列進行大規模和高通量分析。Sergeev等[19]應用此方法分析位于VZV ORF22中的5個可變點，分析了VZV參考株6株和2001～2002年美國臨床分離株130株的基因型，結果與用其他方法的分型結果一致，可快速、靈敏地將VZV分為E型(81.5%)，J型(3.0%)和M型(15.5%)三種主要基因型，另外還檢測到M型的新亞型?；蛐酒夹g分型的靈敏度高，且雜交片洗滌后可直接進行掃描，操作簡便，發展潛力巨大，但需要特殊設備，且費用昂貴。

3.7二分檢索 二分檢索又稱折半檢索，適用于不經常變動而檢索頻繁的有序列表。Schmidt-Chanasit等[20]用二分檢索分析法選擇VZV基因組中從ORF51～ORF58四個位點，將德國野生株和Oka疫苗株進行對比分析，結果顯示德國野生株中33%為A型，67%為D型；Oka疫苗株為B型，他們用同樣方法分析了其他地方分離株，得到的結果與用其他分析方法(如異源雙鏈泳動法和系統進化分析)所得的結果一致。二分檢索的優點是比較次數少，檢索速度快，平均性能好；缺點是要求待查表為有序表，且插入刪除困難。

4 VZV基因分型方案

目前VZV基因分型方案多基于SNP進行。較常用的方案有基于散在SNP方案：Barrett-Muirt等[18]分析VZV ORF1、ORF21、ORF50、ORF54中的SNP，把在英國流行的VZV株分為A型、B型、C型和J型四個基因型，B型可能是A型和C型的組合?；贠RF22方案：美國疾病控制與預防中心的Loparev等[11]對從27個國家分離得到的326株VZV的ORF22進行測序分析，并根據其中的6個SNP位點(37902，38019，38055，38081，38177和38229)將這些毒株劃分為三個基因型，分別命名為E,J,M型，其中與Dumas株同源者定為E型，與pOka株同源者定位J型，介于兩者間者定為M型，E型、J型間差異最大，M型介于兩者之間并被認為是E型和J型的組合，ORF22 SNP方案如聯合ORF21或ORF50中SNP，可區分出五個主要基因型(E1,J,E2,M2,M1)和兩個次要基因型(M4和M3)，其對應的VZV基因型通用名即進化枝1,2,3,4,5,Ⅵ,Ⅶ[6]。基于糖蛋白/IE62方案：Faga等[16]分析了gB(ORF31)、gE(ORF68)、gH(ORF37)、gI(ORF67)、gL(ORF60)和IE62(ORF62)6個基因多態性位點后，將VZV分為A,B,C和D四個基因型，該方法被改進后還用于新家坡和泰國VZV毒株基因分型[15]。

2008年英國倫敦舉行的VZV基因型命名專題會議上建議根據VZV全基因組序列統一將VZV分成五個進化枝(即進化枝1,2,3,4和5)和臨時進化枝(進化枝Ⅵ和Ⅶ)[15]。VZV各進化枝對應的參考毒株及四種基因分型方案之間的關聯見表1[21]。

表1 VZV參考毒株及四種基因分型方案之間的關聯

VZV基因型在世界各地分布具有顯著的地域特征，其基因型的變化還可以在一定程度上反映移民情況，如在移民比較多的國家(如美國、英國和巴西等)VZV基因型盡管以B和C為主，但是所有其他基因型均可被檢出[21]。

5 展 望

VZV基因分型的意義主要體現在流行病學和疫苗研制方面。在流行病學上，VZV基因分型可以幫助掌握VZV分子流行病學特征，迅速查明毒株來源，追蹤VZV在易患人群中的傳播狀況，切斷傳播路線，控制疫情的蔓延，同時有助于解釋不通患者特有的臨床表現；在疫苗研制和使用上，水痘疫苗要想達到對某個地區最大的保護作用，就必須知道該地區VZV基因型，做到疫苗的特異使用?；蚍中团c地理分布、病毒感染與疫苗預防效果之間的關系，還需要進行更大樣本研究。隨著分子生物學的發展，對VZV基因型的研究將更加深入，這對了解各個國家VZV分子流行病學特點，探索其發病機制，以及感染的預防及治療都具有重要意義。

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