遞送系統搭載防齲基因疫苗的研究現狀

李 虎，亓 鵬(綜述)，劉建國(審校)

(遵義醫學院口腔學院，貴州 遵義 563000)

防齲基因疫苗可采用不同的接種方式,如肌內注射、口服、鼻腔滴注、扁桃體和小唾液腺區域皮下注射等，不同免疫方式所產生的免疫效價存在差異，遞送系統的作用就是幫助疫苗跨越黏膜屏障，增強抗原的攝取效率，減少抗原的降解。理想的載體材料應具有良好的生物相容性、可降解性、穩定性以及低細胞毒性。

齲病是一種非致死性慢性疾病，患者又以兒童和老年人居多，而且接受性較差。防齲疫苗的研發需要考慮患者的接受程度，因此尋找一種低成本、安全可靠、接種方便的途徑就顯得尤為重要。目前疫苗一般采用肌內注射或皮下注射的方式增強疫苗抗原的免疫原性，誘導特異的抗體反應，從而產生較大的細胞反應。免疫的同時往往伴有較為強烈的短暫性疼痛，可能引起局部劇烈的炎性反應。通過黏膜途徑佐劑誘導分泌特異性S-IgA的免疫應答方式成為研究熱點[1-2]。黏膜傳遞可產生系統性免疫應答，但強度較注射途徑弱。目前研究的新型遞送系統主要有殼聚糖、水凝膠、脂質體等，其能有效地促進黏膜局部的免疫反應，具有安全、簡捷、無創傷等優點，并且能夠增強抗原呈遞功能，具有免疫佐劑的效應。

1 殼聚糖

殼聚糖是天然多糖類陽離子高分子材料，是一種線性多糖，具有良好的生物可降解性和生物相容性，其毒性低，已廣泛應用于藥物制劑中。

疫苗口服免疫時，由于胃腸道環境對疫苗抗原的降解作用，常常需要多次免疫，而且易產生免疫耐受；鼻腔黏膜接種疫苗，疫苗通過的距離短，且只能在鼻腔內停留15 min左右，但此途徑不受低pH和酶降解的影響。無論是單純口服接種還是鼻黏膜接種都很難通過上皮屏障，到達微皺褶細胞，從而難以高效刺激產生黏膜反應。殼聚糖作為免疫佐劑與疫苗抗原混合制備成微粒，其表面帶正電荷的微粒會延長疫苗抗原在鼻腔的滯留時間，同時也增加抗原對免疫細胞的刺激時間，提高黏膜局部免疫和系統免疫，從而提高疫苗的免疫效果[3]。李宇紅等[4]將殼聚糖和防齲DNA疫苗制備成微粒，通過掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡發現其分布均勻，大小一致，直徑<10 μm，以免疫組織化學法證明質粒可轉染入細胞并能正確表達特異性蛋白，認為其能被微皺褶細胞攝取，對DNA有保護作用。殼聚糖與質粒DNA通過靜電力作用，結合形成的納米粒明顯提高了基因疫苗的黏膜免疫效果。疫苗與殼聚糖相混合能夠保護抗原免受機體各種酶的降解，促進微皺褶細胞的吸收，不僅能誘導有效的黏膜和系統免疫，還能增強所誘導的免疫反應。殼聚糖本身具有免疫刺激活性，能夠增加機體抗病毒能力，提高細胞之間的聚集和活化，增強遲發型變態反應和細胞毒性T細胞反應。

Bolhassani等[5]研究發現，以殼聚糖為載體的疫苗微粒系統可以提高抗原呈遞細胞的靶向性，保護疫苗抗原，并在機體內起到緩釋的作用。殼聚糖包裹的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子和抗癌藥物可通過誘導CD8+細胞介導的抗腫瘤免疫反應，促進抗腫瘤作用。將不同濃度的殼聚糖加入到包含抗原的流感病毒亞單位疫苗中(15 mg/L)，對小鼠進行二次免疫，21 d后發現加入0.5%殼聚糖的疫苗能誘導出3～5倍高滴度抗體[6]。將殼聚糖與疫苗混合經腹腔注射免疫BALB/c小鼠后，能夠在血清和鼻腔洗液中檢測到相關的特異性抗體。殼聚糖作為佐劑能提高小鼠抗病毒攻擊的能力，可作為一種新型的遞送材料增強疫苗的抗原-抗體反應。

雖然以殼聚糖為遞送系統搭載疫苗廣泛應用于臨床還有待于進一步研究，但其作為黏膜免疫遞送系統，為口服防齲疫苗提供了新的思路和借鑒之處。

2 脂質體

脂質體由不同比例的脂質與膽固醇構成，為雙分子層的封閉小囊泡。脂質體無毒，可生物降解，通常擁有極低的免疫原性，不會導致宿主變態反應和自身免疫反應。脂質體種類繁多，按其所帶電荷可將其分為陽離子脂質體、陰離子脂質體和中性脂質體，按其結構類型又可分為單層脂質體、多層脂質體和多囊脂質體等。陽離子脂質體是一種新型的非病毒基因載體，通常帶有正電荷，能夠與帶有負電荷的細胞膜相互吸引，有助于靠近細胞。脂質體能夠與DNA或蛋白質通過靜電相互作用，形成小粒徑的復活物，有助于細胞攝取，同時能避免被機體內的酶降解，在理論上可以獲得更大的佐劑活性和人體安全性。陽離子脂質體可作為很多蛋白藥物的黏膜載體，其亦能作為蛋白疫苗的載體[7]。

脂質體能夠對特定組織進行靶向聚集。在表面嵌入抗體的脂質體稱作免疫脂質體，通過抗原識別介導脂質體與靶細胞結合。在脂質體表面也可以嵌入組織特異性細胞間黏附分子，可以實現細胞水平的藥物導向，使脂質內包裹的藥物在靶細胞表面釋放或通過細胞膜與脂質體膜融合，實現藥物在靶細胞胞質的釋放。在防齲疫苗的應用中，楊亞萍等[8]利用陽離子脂質體乳劑(CLE)分別包被防齲DNA疫苗(pGJA-P/VAX)和重組變形鏈球菌表面蛋白(rPAc)疫苗免疫小鼠，用DNA初免，2周后以蛋白加強免疫的策略鼻滴免疫6～8周齡的BALB/c小鼠，結果顯示實驗組(CLE/DNA初免+CLE/rPAc加強免疫組)能產生較對照組(DNA初免+rPAc加強免疫組)更持久的黏膜免疫反應，同時能增加血清特異性IgG和唾液特異性IgA抗體的水平。楊柳等[9]利用中試生產的LE-pGJA-P/VAX質粒通過與脂質體LE溶液直接混合制備LE-pGJA-P/VAX復合物，通過正負電荷吸引，組裝成LE/DNA納米粒子，經細胞轉染證實其可正確表達目的蛋白。

有學者認為將靶向脂質體進行多肽修飾處理后，能夠借助受體與多肽配體的相互作用，將脂質體靶向運輸到含有配體的特異性受體器官、組織或細胞，同時受體與配體結合可促進脂質體內化進入細胞內[10]。多肽修飾的脂質體能夠較好地增加藥物的選擇性，進一步減少藥物對組織或細胞造成的不良反應，提高藥物治療指數。脂質體作為載藥體系遞送藥物具有顯著優勢，既可免受胃腸道中酸和蛋白水解酶的破壞，又具有一定的靶向性，增加抗原的吸收。但脂質體本身的穩定性、制作成本、脂質體和納米粒藥物動力學以及質量檢驗等問題還有待于進一步的研究，只有在分子水平解決其運輸機制，才能有助于脂質體作為遞送系統大范圍的應用。

3 水凝膠

水凝膠是在空間上呈三維網狀結構的一類高分子材料，因其具有獨特的吸水性和良好的生物相容性等優點而備受關注。這類材料除了具有良好的物理化學性質外，還擁有藥物釋放方面的可控性、生物方面的黏附性以及可降解性等新型遞送系統所具備的特性。目前水凝膠已在生物醫藥基因疫苗、組織工程、功能材料等相關領域廣泛應用，尤其是在抗生素、抗體、酶、疫苗、避孕藥以及激素等藥物傳送方面[11]。

目前研究較為熱門的是智能型水凝膠，它是一種根據外界環境的刺激而產生不同反應，再進一步進行處理并具有執行功能的高分子材料，目前已應用于多個領域。在醫學方面以溫度敏感性水凝膠和pH敏感型水凝膠的研究較多見，其能夠搭載一些新型藥物并能達到在人體內控釋、脈沖釋放、觸發式釋放和提高藥效的目的。

溫度敏感性水凝膠高分子材料對于溫度的變化非常敏感，該凝膠具有最低臨界共溶溫度，其溶脹與收縮性隨溫度變化并不呈線性，而是在某一溫度下水凝膠的體積表現為突然的收縮和膨脹，具體表現為在較低溫度下溶脹度較高，在相對較高溫度下溶脹度較低。將此類水凝膠作為藥物的緩釋系統，對機體在不同溫度下進行可控性釋放的研究具有非常重要的意義。孫佳麗等[12]用化學方法得到了水溶性良好、同時在37 ℃時水凝膠溶膠向凝膠轉變時間<10 min的改性材料殼聚糖-單甲氧基聚乙二醇(chitosan-methoxy poly polyethylene glycol,CS-mPEG)；經體外釋藥實驗發現，CS-mPEG水凝膠控釋作用較好，親水能力強，有助于保護蛋白活性不被破壞。吉秋霞等[13]制備殼聚糖-殼聚糖季銨鹽/甘油磷酸溫敏水凝膠，通過檢測其對牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌和伴放線桿菌產生的抑制作用，證實它不僅可作為藥物載體參與局部緩釋系統的組成，同時還可作為活性因子參與殺菌、抑菌。亓鵬[14]通過溫敏性水凝膠搭載防齲DNA疫苗免疫SD大鼠，研究發現疫苗在大鼠體內可以起到緩釋作用，通過齲齒記分分析，疫苗免疫SD大鼠后能夠有效抑制齲齒的發生，同時檢測到SD大鼠體內的特異性抗體(S-IgA/IgG)在一段時間內維持較高水平。

人體胃液的pH值一般為0.9～1.5，而腸液為6.5～8.0，利用水凝膠在不同pH值時的溶脹效果不同，能夠將藥物直接輸送到作用的靶細胞或器官，防止在輸送過程中被吸收或降解。腫瘤細胞與正常細胞之間的pH值也存在差異，這種水凝膠的研究也為未來口腔腫瘤的治療提供了新的思路，通過pH值控制藥物的釋放，確保藥物能最有效地到達腫瘤細胞。Kim等[16]在研究新型的甲基丙烯酸-乙二醇共聚物Poly[methacrylic acid-co-poly(mono ethylene glycol),P(MAA-co-MEG)]、聚甲基丙烯酸接枝聚乙二醇Poly[methacrylic acid-grafted-poly(ethylene glycol),P(MAA-g-EG)]等pH敏感型水凝膠時發現，這類水凝膠對胰島素的包裹超過90%。在堿性條件下，凝膠收縮，胰島素釋放緩慢；當pH升至6.5時，凝膠迅速膨脹，胰島素釋放速度明顯加快。這種在中、堿性條件下收縮和溶脹的水凝膠多屬于陰離子水凝膠，其能夠防止多肽、蛋白類藥物被胃液降解，同時因其具有生物黏性和膨脹能力，因而可有效促進藥物釋放、吸收。絡合Ca2+的水凝膠還能夠促進載體的透膜吸收，從而有效抑制胰蛋白酶的水解作用[17]。

其他水凝膠包括磁性水凝膠、快速響應水凝膠、葡萄糖敏感型納米凝膠等。磁性水凝膠一般分為三種結構：①內核為磁性材料、殼為聚合物材料；②內核為聚合物高分子材料、外殼是磁性材料；③內層以及外層都為聚合物高分子材料、中間的夾層為磁性材料[18]。這種性質的水凝膠能夠吸附到靶區附近，使靶區很快達到所需的藥物濃度，避免藥物損耗，加速藥效產生，提高療效，降低總給藥劑量；由于絕大部分藥物被吸附到局部，相對減少了藥物對人體正常組織的損害，特別是降低了對肝、脾、腎等器官的損害。作為防齲疫苗的遞送系統，水凝膠擁有獨特的發展潛力，可通過口服或鼻滴免疫，其緩釋作用能夠比較平穩的釋放藥物，達到一個長期的給藥過程。由于水凝膠具有良好的生物相容性，能較好的保護疫苗不被降解，從而提高藥物的使用效率。目前水凝膠的研究主要集中在制備工藝的研究上，藥物控釋、傳輸理論及應用研究還不夠深入，同時因水凝膠力學性能較差等方面的限制，要將水凝膠運用到實際的臨床中還有待更深入的研究，但其作為口服防齲疫苗的搭載系統為廣大學者提供了新的研究方向，具有很好的應用前景。

4 微球與納米粒

微球系指藥物與適宜的載體材料通過微型包囊技術制得的球形或類球形微粒，粒徑為1～250 μm。目前，以聚酯類為載體材料的微球制劑研究較為廣泛[19]，其中研究較多的是乳酸-羥乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)，即PLGA微球，PLGA是丙交酯與乙交酯的單體所形成的共聚物，兩種單體比例不同，聚合物的結晶度也不同。微球降解屬水解反應，降解時間也不相同，但降解產物均為人體正常的代謝產物。目前，微球已經普遍應用于黏膜免疫傳遞系統，此類材料可以包裹小分子藥物以及大分子蛋白或質粒DNA。Mohaghegh等[20]發現，用微球包裹質粒鼻腔給藥免疫兔后，免疫組的IgG和IgA抗體水平顯著高于對照組，顯著提高了免疫反應水平。構建的豬流感DNA疫苗微球，通過黏膜免疫后，可刺激機體產生較強的細胞免疫、體液免疫和黏膜免疫，提示此類免疫遞送系統安全性較好[21]。

納米粒具有生物降解性、生物相容性、靶向性、低毒性、藥物定位傳遞以及能使藥物或疫苗抗原長效釋放和增強表達的特點，不僅可引起全身系統免疫反應，還可以產生較強的局部黏膜免疫反應，同時由于制備的納米粒能穿過組織間隙，大小與病原體相當，可通過機體最小的毛細血管，因此可生物降解納米粒已被廣泛應用于藥物或疫苗遞送系統和基因治療研究中。Rajapaksa等[22]研究表明，PLGA納米粒能提高微皺褶細胞的吞噬能力，為納米粒黏膜免疫遞送系統機制的研究奠定了基礎。

5 細菌菌蛻

細菌菌蛻是在革蘭陰性菌中誘導表達來自噬菌體PhiX174的E基因，導致細胞裂解，形成完整的細菌空殼。細菌菌蛻除了具有組合抗原免疫原性、佐劑效應、還具有靶向性載體的作用，特別適合黏膜免疫及口服免疫。作為新型的非活性疫苗，可誘導機體產生有效的體液免疫和細胞免疫，包括黏膜免疫應答。細菌菌蛻可以作為重組蛋白、核酸以及藥物等的遞送載體。與常規DNA遞送系統相比，細菌菌蛻的裝載效率高，在有效保護DNA不被降解的同時，高效介導DNA靶向到抗原呈遞細胞，實現基因的高效表達[23]。細菌菌蛻還能夠誘導機體產生抗原特異性免疫應答。細菌菌蛻的制備無需劇烈的物理和化學處理，細胞膜保留完整，賦予其天然的佐劑特性，菌蛻可以通過發酵方式生產，且冷凍干燥的菌蛻在室溫下可長期保存，不會造成效率的損失。目前相關研究主要集中在細菌菌蛻的裝載效率和體外轉染效率兩個方面。沙眼衣原體重組菌蛻和流感嗜血桿菌重組菌蛻已進入到了臨床試驗階段，而防齲用變異鏈球菌菌蛻方面的研究還未見報道。

6 小 結

國內目前尚無將基因疫苗應用于臨床的報道，但基因疫苗對豬流感病毒、豬瘟病毒、雞的禽流感病毒、牛皰疹病毒以及部分寄生蟲的防治已取得了一定的成效。防齲基因疫苗的免疫機制尚不明了，而安全性和藥動學也是日后需要研究和探索的重要方面。疫苗遞送系統目前大多處于實驗室研究階段，還有許多問題待解決，但其出現給防齲疫苗帶來了希望。隨著研究的深入，基因疫苗能夠根據各自特點和不同的免疫途徑搭載相對應的載體，以達到效價最大化。希望在不久的將來防齲基因疫苗可以應用到臨床，真正的造福人類。

[1] 梅麗琴,曲云鵬,麻建豐,等.免疫分子佐劑ctxB在pVAX1中的初步應用[J].溫州醫學院學報,2012,42(1):24-26.

[2] Flores J,DuPont HL,Paredes-Paredes M,etal.Pilot study of whole-blood gamma interferon response to the vibrio cholerae toxin B subunit and resistance to enterotoxigenic escherichia coli-associated diarrhea[J].Clin Vaccine Immunol,2010,17(5):879-881.

[3] 張曉艷,趙凱,侯志勇,等.殼聚糖及其衍生物作為免疫佐劑的研究進展[J].中國新藥雜志,2012,21(2):138-143.

[4] 李宇紅,樊明文,邊專,等.殼聚糖2防齲DNA 疫苗微粒的制備和體外表達研究[J].中華口腔醫學雜志,2004,39(6):522

[5] Bolhassani A,Safaiyan S,Rafati S.Improvement of different vaccine delivery systems for cancer therapy[J].Mol Cancer,2011,10:3.

[6] Ghendon Y,Markushin S,Krivtsov G,etal.Chitosan as an adjuvant for parenterally administered inactivated influenza vaccine[J].Arch Virol,2008,153(5):831-837.

[7] Tiwari S,Agrawal GP,Vyas SP.Molecular basis of the mucosal immune system:from fundamental concepts to advances in liposomebased vaccines[J].Nanomedicine(Lond),2010,5(10):1617-1640.

[8] 楊亞萍,劉明諄,閔智鵬,等.陽離子脂質體乳劑增強防齲疫苗黏膜免疫效果的研究[J].口腔醫學研究,2011,27(10):849-852.

[9] 楊柳,楊穎,林玉紅,等.LE-pGJA-P/VAX黏膜遞呈系統的制備及其理化性質評價[J].口腔醫學研究,2012,28(3):218-219.

[10] 吳學萍,王馳.多肽修飾脂質體靶向藥物遞送系統研究進展[J].中國現代應用藥學,2010,27(8):681-685.

[11] 尹大偉,周英,劉玉婷,等.水凝膠的最新研究進展[J].化工新型材料,2012,40(2):21-24.

[12] 孫佳麗,蔣國強,丁富新.殼聚糖-mPEG溫敏水凝膠載藥系統的制備及釋藥行為[J].清華大學學報：自然科學版,2010,50(6):909-912.

[13] 吉秋霞,鄧婧,于新波,等.殼聚糖基溫敏水凝膠對牙周常見致病菌的抑制作用[J].上海口腔醫學,2009,18(4):397-400.

[14] 亓鵬.溫敏型生物降解水凝膠載體防齲基因疫苗不同途徑免疫SD大鼠的實驗研究[D].遵義：遵義醫學院,2011.

[15] 劉慶堂.pH-敏感型水凝膠在多肽和蛋白質藥物給藥系統研究中的應用[J].當代醫學,2011,17(34):136-137.

[16] Kim B,Peppas NA.In vitro release behavior and stability of insulin in complexation hydrogels as oral drug delivery carriers[J].Int J Pharm,2003,266(1/2):29-37.

[17] 陳旭日,陳學剛.新型P(NIPAAm-co-IA)pH敏感智能水凝膠的合成與性能研究[J].化學推進劑與高分子材料,2011,9(2):92-96.

[18] 張鴻儒,劉文濤,何素芹,等.磁性水凝膠研究進展[J].材料導報,2009,23(2):106-110.

[19] Tran VT,Benoti JP,Venier-Julienne MC.Why and how to prepare biodegradable,monodispersed,polymeric microparticles in the field of pharmacy?[J].Int J Pharm,2011,407(1/2):1-11.

[20] Mohaghegh M,Tafaghodi M.Dextran microspheres could enhance immune responses against PLGA nanospheres encapsulated with tetanus toxoid and Quillaja saponins after nasal immunization in rabbit[J].Pharm Dev Technol,2011,16(1):36-43.

[21] Zhao K,Li GX,Jin YY,etal.Preparation and immunological effectiveness of a Swine influenza DNA vaccine encapsulated in PLGA microspheres[J].J Microencapsul,2010,27(2):178-186.

[22] Rajapaksa TE,Stover-Hamer M,Fernandez X,etal.Claudin4-targeted protein incorporated into PLGA nanoparticles can mediate M cell targeted delivery[J].J Control Release,2010,142(2):196-205.

[23] 溫晶,寇志華.細菌菌蛻DNA疫苗遞送系統研究進展[J].中國人獸共患病學報,2010,26(9):858-861.