柯薩奇-腺病毒受體在肺癌組織中的表達及其與臨床病理因素的相關性研究

郭廣秀，張功亮，肖軍蘭，黃金長，王建

(贛州市人民醫院 病理科，江西 贛州 341000)

柯薩奇-腺病毒受體 (Coxsackie and adenovirious receptor，CAR)是柯薩奇 B病毒(CBV)和腺病毒(ADV)與靶細胞結合的共同受體。CAR因其作為腺病毒受體介導攜帶治療基因的腺病毒載體進入宿主細胞發揮治療作用而受到廣泛關注[1]。CAR作為細胞間粘附分子，參與了多種腫瘤發生發展的病理過程[2]。本文應用免疫組化方法檢測CAR在肺癌和癌旁組織中的表達情況，并分析其與臨床病理因素之間的關系。

1 材料與方法

1.1 一般材料 收集2009年1月至2012年12月我院病理診斷明確的肺癌手術切除標本70例、支氣管鏡活檢標本5例，其中鱗癌43例，腺癌27例，小細胞癌5例。同時采用癌旁(距離癌腫5cm以外)組織作為對照組。所有組織均經10%中性緩沖福爾馬林固定10h，石蠟包埋組織。

1.2 試劑 鼠抗人CAR單克隆抗體購買自美國Upstate公司，EnVision試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法及步驟 免疫組化EnVision法：觀察存檔肺癌及癌旁組織玻片，挑選對應最佳蠟塊，4um切片，60℃考片1h，二甲苯脫蠟后置酒精，水化后置入PBS液，3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶，用0.01M、pH6.0枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復，100℃15min，自然冷卻，CAR(1:100)一抗孵育，4℃過夜，0.01M、pH7.2～7.4PBS 沖洗 10min， 再用 En-Vision 二抗孵育，37℃ 60min，0.01M、pH7.2～7.4PBS沖洗10min，DAB顯色(顯微鏡下觀察，及時終止顯色)，蘇木素襯染，二甲苯透明，中性樹膠封片。用PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判定 所有切片均經由兩位有經驗的病理醫師進行閱片、計數及判斷。隨機選擇5個高倍鏡視野(×400倍)，呈色強度得分：未染色0分，黃色1分，棕黃色2分，棕黑色3分。呈色百分率得分：無陽性細胞 0分，＜25%1分，25%～50%2分，＞50%3分。兩項得分相加即為CAR表達的最后得分：0 分為(-)，1～2 分為弱陽性(+)，3～4 分為中度陽性(++)，5～6 分為(+++)。表達程度分為：(-)和(+)為陰性表達，(++)和(+++)為陽性表達。

1.5 統計學方法 應用SPSS17.0統計學軟件，應用χ2檢驗對不同組織間CAR表達的差異進行比較，并分析其與臨床病理因素的關系，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CAR在肺癌及癌旁組織中的表達 CAR陽性定位于細胞膜上，胞漿內少量表達，呈棕黃色顆粒狀。肺癌組織著色較深(++)～(+++)，多呈彌漫陽性(圖1)，而癌旁組織著色較淺，且呈灶性陽性(圖2)。

圖1 CAR在鱗癌組織中表達，呈彌漫陽性 SP法(×200)

圖2 CAR在癌旁組織中的表達，呈灶性陽性SP法(×200)

CAR在肺癌組織中的陽性表達率為57.3%(44/75)，癌旁組織中的陽性率 9.3%(7/75)，兩者間差異有統計學意義(P＜0.01)(見表1)。

表1 CAR在肺癌及癌旁組織中的表達[n(%)]

2.2 肺部組織CAR表達與臨床病理因素的關系在不同的臨床病理因素中，CAR的表達在淋巴結轉移中差異有統計學意義(P＜0.05)，但在患者不同性別、年齡、吸煙與否、腫瘤大小、TNM分期等因素中差異無統計學意義(P＞0.05)。CAR在腺癌及小細胞癌中的表達陽性率分別為74.1%(20/27)、80.0%(4/5)，而鱗癌僅為46.5%(20/43)，三者間差異有統計學意義(P＜0.05)(見表 2)。

2.3 CAR的表達在肺鱗癌及腺癌不同組織學分級中的差異均無統計學意義 (P＞0．05)(見表3)。

3 討論

柯薩奇-腺病毒受體(CAR)是分子量為45KD的Ⅰ型跨膜單倍，能夠介導腺病毒與靶細胞的結合，在以腺病毒為載體的基因治療領域起著重要作用[3]。CAR表達具有組織特異性和物種特異性[4]，在人類胰腺、腦、心臟、小腸、睪丸以及前列腺中含量最高，在肝臟和肺中有少量表達，而在腎臟、胎盤、末梢血白細胞，胸腺和脾臟中則無。CAR作為細胞間粘附分子，可能參與了多種腫瘤發生發展的病理過程，在多種腫瘤細胞中CAR表達均有不用程度的降低或缺失，并且隨著腫瘤的惡性度增高，CAR的表達丟失更明顯。Jonas等[5]研究發現，CAR在神經膠質瘤組織中表達下調，Ⅱ期和Ⅲ期腫瘤CAR表達高于Ⅳ期，其間差異明顯。在前列腺組織中，CAR無論是在表達強度還是表達率上都較正常前列腺組織發生明顯下調，且隨著腫瘤惡性程度的升高，其下調也愈明顯。在膀胱尿路上皮癌也出現類似現象，而且CAR表達水平與腫瘤的病理分級、肌層侵犯、區域淋巴結轉移以及P53表達密切相關。然而，近來的研究發現[6]，在大多數骨肉瘤細胞系中CAR高度表達。Ito等發現鼠骨折模型中非成熟的成骨細胞亦有CAR的高水平表達。另外，所有的Ewing氏肉瘤細胞系都有CAR的高表達。所以我們可以看出，CAR在不同類型腫瘤中發揮著不同的生物學功能，在有些腫瘤中扮演了抑制腫瘤生長、轉移及侵襲的角色，而在另一些腫瘤中發揮著相反的作用。Qin等[7,8]發現在體外試驗表面CAR表達有利于非小細胞肺癌的形成，同時預示在體內CAR的表達在腫瘤的增殖中是必須的，并且激發肺癌細胞某種亞型的有效形成中也是必須的。以腺病毒為載體的基因治療由于具有技術成熟、操作簡便和安全性好等優點，進展尤為迅速。在本研究中，肺癌組織中CAR的表達水平顯著高于癌旁組織，提示CAR在肺癌的發生發展中起到了重要作用。但CAR的表達在肺鱗癌、腺癌不同組織學分級中的差異無統計學意義，說明CAR的表達可能與肺鱗癌及腺癌惡性程度無明顯相關性。

表2 肺癌組織CAR表達與臨床病理因素的關系[n(%)]

表3 鱗癌及腺癌不同組織學分級中CAR表達比較[n(%)]

CAR為細胞表面的病毒受體，在細胞粘附、上皮細胞極性形成以及細胞的接觸抑制機制等方面起著重要作用，并可以抑制腫瘤的惡性進程及侵襲轉移[9]。本研究結果表明，在不同的臨床病理因素中，CAR的表達在淋巴結轉移中有統計學差異，發生淋巴結轉移的病例CAR表達的陽性率較低，說明CAR在一定程度上抑制了肺癌細胞向淋巴結轉移。但在患者不同性別、年齡、吸煙與否、腫瘤大小等因素中差異無統計學意義(P＞0.05)。值得注意的是，TNM分期中Ⅰ~Ⅱ期CAR陽性表達率較高(66.7%，28/42)，Ⅲ~Ⅳ期陽性率較低(48.5%，16/33)，說明CAR的表達與肺癌的TNM分期可能有一定的關系，即TNM分期越晚，CAR表達越不顯著，但尚未達到有統計學差異的程度，分析其原因可能為：肺癌TNM分期不單與淋巴結轉移有關，還與腫瘤大小及是否有遠處轉移有關，這幾個因素都會對統計學結果產生影響，也有可能與本研究樣本量較小有關，更為精確的統計學分析有待于今后擴大樣本進一步研究。

本研究還發現，CAR在不同組織類型的肺癌細胞中表達存在統計學差異，腺癌及小細胞癌的CAR表達明顯強于鱗癌的表達，說明CAR的表達與腫瘤細胞起源有關，并與肺腺癌及小細胞癌形成發展關系更為密切，與顧安康[10]、鮑永儀等[11]的報道一致，這將為我們選擇靶向藥物或基因治療不同組織學類型的肺癌提供一定的理論依據。

本研究不足之處：本研究屬于小樣本分析，更為精確的結果有待于更大樣本的研究。另外關于CAR對肺癌細胞具體的作用機制還不清楚，CAR與肺癌的增殖指數及預后等的關系還有待于進一步研究。

[1]董元煥.柯薩奇病毒腺病毒受體與腫瘤的研究[J].牡丹江醫學院學報,2012,33(2):55-57.

[2]Yamashita M,Ino A,Kawabata K,et al.Expression of CAR reduces the lungmetastatic potential ofmurine tumor cells[J].Int Cancer,2007,121(8):1690-1696.

[3]張林琳,賀大林.柯薩奇-腺病毒受體在腎癌組織中的表達及意義[J].中國腫瘤臨床,2005,32(20):1141-1143.

[4]Ito M,Kodama M,Masuko M et al.Expression of Coxsackievirus and adenovirus receptor in hearts of rats with experimental antoimmunemyocarditis[J].Circ Res,2000,86(3):275-280.

[5]Fuxe J,Liu L,Malin S,et al.Expresson of the Coxsackievirus and adenovirus receptor in human astrocytic tumor and xenografts[J].Int JCancer,2003,103(6):723-729.

[6]Schmidtke M,Selinka HC,Helm A,et al.Attachment of Coxsackievirus B3 Variants cell lines:mapping of phenotypic differences to capsid protein VP1[J].Virology,2000,275(1):77-78.

[7]Qin M,Chen S,Yu T,et al.Coxsackievirus adenovirus receptor expression predicts the efficiency of adenoviral gene transfer into non-small cell lung cancer xenografts.Clin cancer Res,2003,9(13):4992-4999.

[8]Qin M，Escuadro B,Dohadwala M,et al.A novel role for the Coxsackie adenovirus receptor in mediating tomor formation by lung cancer cells.Cancer Res,2004,64(18):6377-6380.

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[10]顧安康,孫蕾娜,陳照立,等.柯薩奇病毒腺病毒受體在非小細胞肺癌中的表達及其意義[J].中華腫瘤雜志,2009,31(4):278-281.

[11]鮑永儀,關乃富,程羽青.小細胞肺癌組織中柯薩奇—腺病毒受體陽性表達的意義[J].臨床腫瘤學雜志,2009,14(2):176-177.