DC-CIK過繼免疫治療聯合化療對食管癌患者T細胞亞群的影響

王浩 蘇文 毛光華 張羽捷 史天良

DC-CIK過繼免疫治療作為繼手術、放化療后第4種治療腫瘤的方式，近幾年已逐漸走進人們的視線，并受到越來越多的重視。DC細胞作為功能最強大的抗原呈遞細胞，可誘發機體免疫反應，產生T細胞和誘發免疫應答的完成[1]。DC能分泌多種細胞因子，如IL-2、IL-12和IFN-γ等TH1型細胞因子，促進CIK細胞成熟和介導TH1型免疫應答；此外，CIK細胞和DC細胞共同培養后能誘導增殖DC的數量，使機體的免疫功能有所提高[2]。DC分泌數量增加，功能增強后，誘導分泌的腫瘤特異性CTL也相繼增加，進而能增強CTL殺傷腫瘤細胞的能力，機體殺傷腫瘤細胞功能更強[3]。本研究對DC-CIK細胞治療食管癌后的T細胞亞群表達水平進行分析，觀察其是否可以提高患者的免疫力。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2009～2013年確診的原發病為食管癌的患者124例，男92例，女32例。根據國際抗癌聯盟（UICC）1977年制定的腫瘤TNM分期進行分期，其中I期84例，II期24例，III期12例，IV期4例。隨機抽取62例患者作為對照組，進行FOL-FOX方案（奧沙利鉑L-OHP+亞葉酸鈣CF+5-氟尿嘧啶5-Fu）化療，化療進行1周期；另外62例患者作為實驗組，行DC-CIK過繼免疫治療聯合FOL-FOX方案化療。化療前行血常規、生化功能檢測、CT、ECT等檢查，檢查結果未見明顯異常。該臨床研究已經本院倫理委員會審查并批準，所有患者簽署知情同意書。

1.2 儀器和試劑 流式細胞儀CAUTO II（美國BD公司）；T淋巴細胞亞群檢測試劑盒（美國BD公司）；TKALA T 551無血清培養基（北京寶日醫生物技術有限責任公司）。

1.3 DC-CIK 的培養 （1）DC 細胞培養： 術前或放化療前2 d用血細胞分離機采集患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，并調整細胞培養密度為2×106mL-1，置于 37℃，5% CO2培養箱中培養2 h，將懸浮細胞移出并向培養瓶中加入GM-CSF、IL-4，每2 d換液1次，并補充相關細胞因子，第6 d加入IFN-γ，誘導DC成熟。（2）CIK細胞培養： 以上述方法采集供者PBMC，用TKALA T 551無血清培養基調整細胞濃度為4×106mL-1，置于37℃，5% CO2培養箱培養2 h，收集上一步的懸浮細胞，計數并用TKALA T 551培養液調細胞濃度為4×106mL-1，第1 d加入細胞因子IFN-γ，24 h后加入CD 3McAb及IL-2，每2 d換液1次。（3）DC細胞和CIK細胞共同培養： 第8 d，將DC細胞與CIK細胞按照1∶10的比例共同培養6 d。細胞培養第0 d及每次收集細胞回輸前取1 mL樣品進行免疫表型檢測。

1.4 治療方案 （1）對照組：第1 d 奧沙利鉑 130 mg/m2，靜滴2 h；第 2～6 d CF 200 mg/m2，5-Fu 500 mg/m2，靜滴4～6 h，21 d為1周期。（2）實驗組：患者行化療前2 d采集外周血50 mL分離提純單個核細胞，用于培養DC-CIK細胞。臺盼藍拒染法檢測細胞成活率＞95%，混懸于含2%白蛋白的200 mL生理鹽水中輸注給患者，輸注細胞數為2×1010個。

1.5 T細胞亞群值 DC-CIK過繼免疫治療后，收集兩組 T細胞亞群 CD 3+、CD 3+CD 4+、CD 4+CD 8+、CD 3+CD 8+、CD 3-CD 16+CD 56+、CD 3+CD 16+CD 56+、CD 4+CD 25HiCD 127Lo的水平以及 CD 3+CD 4+/CD 3+CD 8+比例的以及實驗組治療前后上述T細胞亞群值的變化。

1.6 統計學方法 實驗組與對照組例數均＞60，可看做均服從正態分布，采用SPSS 19.0軟件對實驗組與對照組，實驗組生物治療前后兩組數據進行兩樣本t檢驗，按α=0.05標準，P＜0.05表示兩樣本均數不等，差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗組和對照組 治療后實驗組較對照組CD 3+、CD 3+CD 8+、CD 3-CD 16+CD 56+、CD 3+CD 16+CD 56+比例普遍升高（P＜0.05）；CD 4+CD 8+比例升高；CD 3+CD 4+、C D 3+C D 4+/C D 3+C D 8+、C D 4+C D 25HiC D 12 7Lo比例普遍下降（P＜0.05，見表1）。實驗組治療后比治療前CD 3+、CD 3+CD 8+、CD 4+CD 8+、CD 3-CD 16+CD 56+、CD 3+CD 16+CD 56+比例普遍升高（P＜0.05）；CD 3+CD 4+、CD 3+CD 4+/CD 3+CD 8+、CD 4+CD 25HiCD 127Lo比例均下降（P＜0.05，見表 2）。

表1 DC-CIK過繼免疫治療聯合化療治療食管癌前后T細胞亞群表達水平的變化（%）

表2 實驗組DC-CIK過繼免疫治療前后T細胞亞群表達水平變化（%）

2.2 實驗組生物治療前后 選擇以上數據做散點圖，選取特征性強的實驗組生物治療前后的CD 3+、CD 3+CD 8+見圖1、圖2；可見實驗組CD 3+、CD 3+CD 8+的值生物治療后平均值明顯高出生物治療前平均值。

圖1 DC-CIK生物治療對食管癌患者實驗組回輸前后CD3+的影響

圖2 DC-CIK生物治療對食管癌患者實驗組回輸前后CD 3+CD 8+的影響

3 討論

Schmidt等[4]和Lander等[5]在1986年報道從人體外周血分離提取單個核細胞并培養出T細胞亞群中CD 3+CD 56+因子，Schmidt Wolf等[6]在1991年做出相關報道。研究表明，DC和CIK共培養后可以增強細胞的殺傷作用，并且可以增加部分T細胞亞群和細胞因子的表達水平。Marten等[7]研究發現，DC和CIK共同培養后DC分泌IL-2水平顯著升高，CIK細胞中CD 3+CD 56+雙陽性細胞比例增加，提高了CIK細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。Fuji等[8]發現CIK細胞可以促進DC分泌CD 80+CD 86+等共刺激分子，從而增強抗腫瘤免疫應答[9]；同時IL-12分泌也增加，而且IL-12誘導CIK細胞分泌的IFN-γ，可進一步激活NKT細胞和誘導Th1型免疫應答[10]。正常人體內CD 4+CD 25+T reg占外周血循環T細胞含量的5%～10%，研究證實，腫瘤患者腫瘤侵犯的淋巴結以及腫瘤局部抑制性T細胞比例明顯升高，其升高與腫瘤的發生發展密切相關，在一定程度上能夠反映腫瘤患者病程進展情況［11］。近年來發現CD 4+CD 25+CD 127LoTreg可作為天然調節細胞，區別自身活化的效應T細胞［12］，是目前發現的特異性較高的細胞表面標志［13］。袁向亮等［14］用CD 127特異性識別T reg細胞方法的建立，在臨床應用中取得較好效果，本文運用流式細胞術三色標記法檢測患者外周血中CD 4+CD 25+CD 127LoTreg的表達水平，能更特異、更準確地反映胰腺癌患者外周血抑制性T細胞的狀態。

近年來，DC-CIK細胞作為第三聯醫療技術已在一些醫院展開臨床實踐，馬洪波等[15]將DC-CIK聯合手術治療原發性肝癌后發現有有顯著效果，CD 3+、CD 4+、CD 4+/CD 8+及NK（CD 16+CD 56+)有顯著上升，隨訪1年復發率低，生存質量明顯提高。劉華等[16]使用DC-CIK聯合化療治療胰腺癌比單純化療組CD 3+、CD 4+百分率和CD 4+/CD 8+比值都升高，同時CD 3+CD 56+雙陽性細胞比例升高。本研究采用DC-CIK細胞治療聯合化療治療食管癌后發現，治療后實驗組較對照組CD 3+、CD 3+CD 8+、CD 3-CD 16+CD 56+、CD 3+CD 16+CD 56+比例普遍升高，（P＜0.05）；CD 4+CD 8+比例升高；CD 3+CD 4+、CD 3+CD 4+/CD 3+CD 8+CD 4+CD 25HiCD 127Lo比例普遍下降（P＜0.05）。實驗組治療后比治療前 CD 3+、CD 3+CD 8+、CD 4+CD 8+、CD 3-CD 16+CD 56+、CD 3+CD 16+CD 56+比例普遍升高（P＜0.05）；CD 3+CD 4+、CD 3+CD 4+/CD 3+CD 8+、CD 4+CD 25HiCD 127Lo比例均下降（P＜0.05）。研究表明，DC 和CIK共培養可以明顯增加CD 3+、CD 3+CD 8+、CD 4+CD 8+的比例，從而在一定程度上增強了T細胞亞群的表達水平，提高患者的免疫力，為臨床實踐提供了很好的理論依據。

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