PTEN與MMP-2在非小細胞肺癌中的臨床意義

鮑振學 毛桂玲 劉云云

PTEN(phosphatase and tensin homologue，PTEN)基因是一種具有雙特異性磷酸脂質酶活性的抑癌基因，是一類與腫瘤的發生、增殖及侵襲轉移有關的基因，其在PI3K/PTEN/AKT信號通路中起關鍵性調控作用，PTEN基因的失活可能在腫瘤的發生、發展以及侵襲轉移中起到重要的作用。MMP-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)是Zn2+依賴性的內源性的蛋白水解酶，參與細胞外基質的降解，與腫瘤的侵襲轉移密切相關。本研究采用流式細胞術的方法，檢測了肺癌組織與相應癌旁正常肺組織中PTEN、MMP-2蛋白的表達情況，分析其與肺癌臨床病理特征及預后的關系，探討PTEN、MMP-2在NSCLC中表達的意義及預后價值，為NSCLC的治療探索新途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2009至2012年確診為原發性支氣管肺癌手術切除標本73例(肺癌組)，男36例，女37例;年齡33～73歲，平均57.6歲。所有標本均經HE染色病理證實。按照AJCC和UICC分期委員會1997年公布修訂的分期標準，鱗癌39例，腺癌34例;高分化25例，中分化26例，低分化22例;Ⅰ、Ⅱ期38例，Ⅲa、Ⅲb期35例;有淋巴結轉移35例，無淋巴結轉移38例。全部病例術前未接受過放療、化療。對照組73例取自對應癌旁正常肺組織(距癌灶邊緣5 cm以外)。所有病例均有完整隨訪資料，隨訪截止日期為2012年12月，生存期的計算從手術日期到隨訪截止日期，或由于復發、轉移而死亡的日期為止。

1.2 流式細胞術檢測方法

1.2.1 免疫熒光染色樣品的制備:切取組織塊，網搓法制備單細胞懸液。取1×106/ml細胞懸液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后懸浮于染色液(PBS+0.1%tritonX－100+10%山羊血清)中30 min，用來增加細胞膜的通透性以及封閉非特異性抗體結合部位。間接免疫熒光法標記，加入染色液1∶50稀釋的兔抗人PTEN抗體(美國Epitomics公司)和鼠抗人MMP-2抗體(北京中山公司)各 40 μl，37℃孵育60 min。PBS 洗滌，分別加入染色液1∶50稀釋的間接免疫熒光標記物熒光素異硫氰酸鹽(fluorescein isothiocyanate，FIT)標記的二抗40 μl，避光室溫孵育30 min，PBS洗滌，除去未結合的熒光抗體，將細胞重新懸浮于1 ml PBS中，過濾后上機檢測。每次檢測以同一患者正常肺組織作為正常對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.2 流式細胞儀檢測方法:采用美國BD公司生產的FACS420型流式細胞儀，激發光源為2 W氬離子激光器，輸出功率300 mW，激發波長為488 nm，進行單參數檢測。所測數據、圖形輸入HP-300Consort30計算機，應用相應軟件處理，測量前以雞紅細胞作為標準品調校儀器的CV值在5%以內。

1.2.3 PTEN和MMP-2表達的定量分析:以熒光指數(FI)表示它們的相對含量，公式:FI=(樣品基因蛋白表達的平均熒光強度－陰性對照的平均熒光強度)/陰性對照的平均熒光強度。FI＞1.0為PTEN陽性表達，FI≤1.0 為陰性表達。

1.3 隨訪 通過電話調查、信件隨訪及入戶調查的方式了解73例肺癌患者從手術之日起2年內是否存活、存活時間及其死亡原因。

1.4 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以表示，采用t檢驗或F檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC與癌旁正常肺組織中PTEN、MMP-2蛋白表達比較 在肺癌組織中PTEN蛋白表達，低于癌旁正常肺組織(P＜0.05)。MMP-2蛋白表達量，高于癌旁正常肺組織(P＜0.05)。見表1。

表1 2組PTEN與MMP-2蛋白表達比較n=73，±s

表1 2組PTEN與MMP-2蛋白表達比較n=73，±s

組別 PTEN t值 P值 MMP-2 t值 P值肺癌組1.85 ±0.14 4.568 0.045 1.15 ±0.28 9.168 0.012對照組1.30 ±0.17 1.56 ±0.57

2.2 PTEN、MMP-2蛋白表達與NSCLC臨床病理特征的關系 PTEN、MMP-2蛋白表達與患者的性別、年齡、吸煙史、腫瘤瘤體大小、病理分型均無關(P＞0.05)。在TNM分期中，Ⅰ+Ⅱ期肺癌組織中PTEN蛋白表達高于Ⅲa+Ⅲb期(P＜0.05);肺癌高分化者PTEN蛋白表達量高于低分化者(P＜0.05)，術后生存期＜2年者PTEN蛋白表達量低于≥2年者(P＜0.05);有淋巴結轉移者PTEN蛋白表達量低于不伴有淋巴結轉移者(P＜0.05)。MMP-2蛋白的表達量隨著TNM分期增加而增加(P＜0.05)，分化程度越低表達量越高(P＜0.05)，術后生存期＜2年者MMP-2蛋白表達量高于生存期≥2年者(P＜0.05);有淋巴結轉移者MMP-2蛋白表達量高于不伴有淋巴結轉移者(P＜0.05)。見表2。

表2 肺癌組織中PTEN和MMP-2蛋白表達與臨床病理特征的關系

3 討論

PTEN是迄今發現的第一個具有雙重特異性磷脂酶活性的抑癌基因，PTEN蛋白能負向調控包括AKT及ERK信號通路在內的多種細胞內信號傳導通路，從而調節細胞正常的生長、發育及抑制腫瘤細胞增殖、粘附和轉移。PTEN是近年來人們發現的新抑癌基因，在多種腫瘤如結直腸癌、黑色素瘤、甲狀腺癌、乳腺癌中表達減少或缺失［1－4］。本研究結果顯示，PTEN在肺癌中的表達量顯著低于癌旁正常肺組織。隨著TNM分期的增加，PTEN的表達量降低，分期越晚，表達量越低;隨著肺癌的分化程度越差，PTEN的表達量就越低;PTEN的表達量水平隨著肺癌淋巴結轉移的發展而呈現下調的趨勢，并且PTEN表達量低者生存期短，說明PTEN參與了肺癌的發生及侵襲轉移過程。

腫瘤浸潤和轉移的重要條件是細胞外基質及基底膜的降解，MMP-2在降解基底膜過程中起著重要作用［5］，有研究表明在許多腫瘤組織如胃癌、結直腸癌、肝癌、乳腺癌中，MMP-2過表達與腫瘤的發生發展密切相關［6－8］。本研究結果顯示，MMP-2在肺癌組織中的表達量顯著高于癌旁正常肺組織。MMP-2的表達量與TNM分期有關，分期越晚，表達量越高;隨著肺癌分化程度的降低，MMP-2的表達量越高;MMP-2的表達水平隨著肺癌淋巴結轉移而呈現上調的趨勢，并且MMP-2高表達者生存期短，說明MMP-2的高表達與肺癌的不良預后有關。

Tian等［9］研究發現，在肝癌中，過表達的PTEN可抑制肝細胞中MMP-2的表達，PTEN可通過PI3K/AKT/MMP-依賴的方式來抑制肝癌細胞的侵襲轉移。本研究發現，PTEN在肺癌組織中表達量減弱或缺失，MMP-2的表達量增加，造成了MMP-2蛋白過剩，從而促進了肺癌細胞的侵襲轉移，其機制可能與PTEN對MMP-2的抑制作用減弱有關。

總之，對PTEN及MMP-2表達的檢測可作為評估肺癌患者淋巴結轉移及預后的指標，PTEN作為一種腫瘤轉移抑制基因，有望成為治療肺癌侵襲轉移的新靶點。

1 Hsu CP，Kao TY，Chang WL，et al.Clinical significance of tumor suppressor PTEN in colorectal carcinoma.Eur J Surg Oncol，2011，37:140-147.

2 Conde-Perez A，Larue L.PTEN and melanomagenesis.Future Oncol，2012，8:1109-1120.

3 Nagy R，Ganapathi S，Comeras I，et al.Frequency of germline PTEN mutations in differentiated thyroid cancer.Thyroid，2011，21:505-510.

4 Gonzalez-Angulo AM，Ferrer-Lozano J，Stemke-Hale K，et al.PI3K pathway mutations and PTEN levels in primary and metastatic breast cancer.Mol Cancer Ther，2011，10:1093-1101.

5 Toupance S，Brassart B，Rabenoelina F，et al.Elastin-derived peptides increase invasive capacities of lung ancer cells by post-transcriptional regulation of MMP-2 and uPA.Clin Exp Metastasis，2012，29:511-522.

6 Partyka R，Gonciarz M，Jalowiecki P，et al.VEGF and metalloproteinase-2(MMP-2)expression in gastric cancer tissue.Med Sci Monit，2012，18:130-134.

7 Langers AM，Verspaget HW，Hawinkels LJ，et al.MMP-2 and MMP-9 in normal mucosa are independently associated with outcome of colorectal cancer patients.Br J Cancer，2012，106:1495-1498.

8 Chen RX，Xia YH，Xue TC，et al.Osteopontin promotes hepatocellular carcinoma invasion by up-regulating mmp-2 and uPA expression.Mol Biol Rep，2011，38:3671-3677.

9 Tian T，Nan KJ，Guo H，et al.PTEN inhibits the migration and invasion of HepG2 cells by coordinately decreasing MMP expression via the PI3K/Akt pathway.Oncol Rep，2010，23:1593-1600.