人肝癌細(xì)胞系7402、7721及癌旁肝細(xì)胞7701在重組腺病毒-胸苷激酶/更昔洛韋系統(tǒng)作用前后差異蛋白檢測及CK18表達(dá)

朱艷培，李 寧，陶 瑩，王 玨，于 瑋，戴 潔*（.首都醫(yī)科大學(xué)臨床病理中心，北京 00069；.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院肝膽外科，北京 00069；.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院病理科，北京0009）

·論著·

人肝癌細(xì)胞系7402、7721及癌旁肝細(xì)胞7701在重組腺病毒-胸苷激酶/更昔洛韋系統(tǒng)作用前后差異蛋白檢測及CK18表達(dá)

朱艷培1，李 寧2，陶 瑩1，王 玨1，于 瑋3，戴 潔1*
（1.首都醫(yī)科大學(xué)臨床病理中心，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院肝膽外科，北京 100069；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院病理科，北京100029）

目的檢測重組腺病毒-胸苷激酶/更昔洛韋（adenovirus-thymidine kinase/gancyclovir,ADV-TK/GCV）系統(tǒng)作用前后人肝癌細(xì)胞株7402、7721及癌旁肝細(xì)胞7701差異蛋白表達(dá)，進(jìn)一步闡明ADV-TK/GCV自殺基因系統(tǒng)作用機(jī)制。方法利用肽質(zhì)量指紋圖譜和雙向電泳分析法檢測ADV-TK/GCV系統(tǒng)對人肝癌細(xì)胞7402、7721及癌旁肝細(xì)胞7701作用前后的差異蛋白；常規(guī)病理學(xué)技術(shù)蘇木精伊紅染色、電子顯微鏡技術(shù)觀察作用前后細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)改變；免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測細(xì)胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK18）的表達(dá)部位、分布范圍及量的變化。結(jié)果7721及7701對ADV-TK/GCV系統(tǒng)作用不敏感，人肝癌細(xì)胞7402經(jīng)自殺基因藥物作用后，多種蛋白表達(dá)呈現(xiàn)出差異性，差異點(diǎn)主要表現(xiàn)為與物質(zhì)能量代謝相關(guān)的酶類及與細(xì)胞骨架相關(guān)的蛋白，7402細(xì)胞的CK18表達(dá)上調(diào)明顯。加藥組7402細(xì)胞死亡明顯，殘留細(xì)胞體積變大，胞漿疏松，空泡變性。電鏡觀察顯示加藥組細(xì)胞器水腫，變化明顯，微絲增多，且多分布于核周圍，凋亡現(xiàn)象明顯。7402免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示加藥組CK18的表達(dá)增強(qiáng)且向核周聚集。結(jié)論ADV-TK/GCV自殺基因系統(tǒng)作用后，敏感株7402蛋白表達(dá)具有差異性，其中CK18表達(dá)顯著上調(diào)且出現(xiàn)分布改變，并引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。

肝腫瘤；差異蛋白；角蛋白質(zhì)類

原發(fā)性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，其因臨床發(fā)現(xiàn)晚，中晚期治療效果差而成為臨床上腫瘤治療的難點(diǎn)[1]。近年來生物治療已成為原發(fā)性肝癌的治療方法之一，基因治療已經(jīng)顯示出了潛在的療效及良好的發(fā)展前景[2]。自殺基因又稱為前藥轉(zhuǎn)換酶基因，可以編碼特殊的酶，催化原先無毒、低毒的前藥形成有較高毒性的代謝產(chǎn)物，從而達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的，并具有先轉(zhuǎn)染后治療、易控制的優(yōu)點(diǎn)[3]，為了進(jìn)一步闡明重組腺病毒-胸苷激酶/更昔洛韋（adenovirus-thymidinekinase/gancyclovir,ADV-TK/GCV）自殺基因治療系統(tǒng)的作用機(jī)制，我們通過從體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞株中提取蛋白[4]進(jìn)行ADV-TK/GCV系統(tǒng)作用前后的差異性檢測，試圖尋找ADV-TK/GCV自殺基因治療系統(tǒng)的作用前后蛋白質(zhì)組的差異性，為肝癌等腫瘤的自殺基因治療提供治療及效果評價(jià)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料：選用高轉(zhuǎn)移、對基因治療敏感的Bel-7402作為實(shí)驗(yàn)組，高轉(zhuǎn)移、對基因治療不敏感的SMMC-7721和癌旁肝細(xì)胞株QSG-7701為對照組，3株細(xì)胞購于北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫。

細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM購于Gibco公司；ADV-TK購于深圳市天達(dá)康基因工程有限公司；輔助用藥GCV購于湖北科益藥業(yè)；差異蛋白檢測試劑購于Sigma公司；一抗鼠抗人CK18、PV9002、山羊血清工作液及HE染色試劑購于北京中杉金橋有限公司；電鏡染色試劑購于中鏡科儀技術(shù)有限公司。

細(xì)胞培養(yǎng)箱購于SANYO公司；石蠟切片機(jī)和超薄切片機(jī)購于德國Leica公司；透射電鏡購于日本JEOL公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理：取7402、7721及7701三株細(xì)胞，設(shè)立實(shí)驗(yàn)組7402（﹢），以ADV-TK和GCV分別處理，對照組7402（-）、7721（-）及7701（-）以等量PBS和GCV處理。以5×105細(xì)胞/瓶接種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基5mL，對照組與實(shí)驗(yàn)組各10瓶進(jìn)行培養(yǎng)。12h后，換液，各組每瓶加入4.9mLDMEM，然后實(shí)驗(yàn)組每瓶加入100μL基因制劑ADV-TK,濃度為5×1010/mL（經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)50%致死率確定），對照組加入等量PBS。溫箱孵育24h，所有細(xì)胞每瓶加入GCV25μL,濃度為2.5×10-4g/mL，使終濃度為1.25×10-6g/mL，48h后用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，凍存。

1.2.2 蛋白提取:取各組凍干細(xì)胞，每管中加入1×全細(xì)胞裂解液10μL,超聲粉碎（冰上進(jìn)行），4℃離心機(jī)，12 000r/min離心5min，取上清液，利用BCA蛋白定量試劑盒的微量測試法，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定蛋白濃度。

1.2.3 雙向電泳實(shí)驗(yàn):將提出的各組蛋白經(jīng)固相pH梯度等電聚焦，平衡、垂直平板電泳，考馬斯亮藍(lán)染色及采集與分析蛋白圖象。1.0mg細(xì)胞總蛋白與重泡漲液（8mol/L尿素,2% 3-[3-（膽酰氨丙基）二甲氨基]丙碘酸丙鹽，0.5%固化電解質(zhì)梯度（immobilineTMDrystrip，IPG）緩沖液1.75L,20mmol/L二硫蘇糖醇7L,痕量溴酚藍(lán)）混合并加入IPG膠槽中，覆蓋油覆蓋IPG膠條，置于固相pH梯度等電聚焦儀中聚焦；然后用含十二烷基磺酸鈉的平衡液平衡；將平衡好的IPG膠條轉(zhuǎn)移至13%聚丙烯酰胺均膠質(zhì)中進(jìn)行垂直平板電泳，20mA/膠電泳40min后換用30mA/膠，直至溴酚藍(lán)前沿抵玻璃板下緣；最后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色及采集與分析蛋白圖象。

1.2.4 肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定蛋白質(zhì)的差異性:將電泳后凝膠中蛋白點(diǎn)切出后，放入含50%乙腈、25mmol/LNH4HCO3的溶液，渦旋混合器振蕩約30min脫色，真空離心干燥，在干燥好的膠塊上加入胰蛋白酶酶液（0.01g/L，在25mmol/LNH4HCO3溶液內(nèi)）進(jìn)行切割，4℃放置15min使酶液完全被吸收，另補(bǔ)加25mmol/LNH4HCO3溶液保濕，37℃溫浴18～20h，收集酶切后的上清進(jìn)行肽段提取后，使用布魯克道爾頓公司的AB4700 的MALDI-TOF/TOF-MS進(jìn)行PMF圖象收集及在線檢索。儀器設(shè)置20kV，正離子，基質(zhì)用α-氰基-4羥基肉桂酸，內(nèi)標(biāo)按照胰蛋白酶自切峰2163.05為校正標(biāo)準(zhǔn)，外標(biāo)為7種標(biāo)準(zhǔn)肽段的混合物。

1.2.5 7402細(xì)胞HE染色:細(xì)胞爬片，3×104/孔接種于24孔板，每孔加入500μL完全DMEM培養(yǎng)基，12h后，換液，實(shí)驗(yàn)組每孔加入400mLDMEM，100μL基因制劑ADV-TK,濃度為1×109/mL，對照組加入等量PBS。溫箱孵育24h，每瓶加入GCV125μL,濃度為1.25×10-6g/mL，48h后,4%多聚甲醛固定30min。蘇木精-伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.2.6CK18免疫細(xì)胞化學(xué)染色:細(xì)胞爬片，加藥，固定2h后，3%H2O2孵育15min,正常山羊血清封閉,滴加一抗?jié)舛?∶200,4 ℃孵育過夜;加二抗工作液,DAB鏡下顯色;蘇木精復(fù)染,酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固。

1.2.7 透射電鏡觀察:細(xì)胞用PBS清洗，離心成 1 小塊，3%戊二醛固定4h，脫水，包埋，聚合，超薄切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察。

2 結(jié) 果

2.1 差異蛋白檢測結(jié)果:肝癌細(xì)胞7721及癌旁肝細(xì)胞7701經(jīng)自殺基因藥物作用后，細(xì)胞生長及形態(tài)學(xué)改變不明顯，蛋白表達(dá)無明顯差異。實(shí)驗(yàn)組肝癌細(xì)胞7402處理后，多種蛋白表達(dá)呈現(xiàn)出差異性，在11個(gè)差異最為明顯的蛋白質(zhì)組中，有6組明顯下調(diào)的差異點(diǎn)主要為與物質(zhì)能量代謝相關(guān)的酶類，有5組明顯上調(diào)的差異點(diǎn)，其中有3組差異點(diǎn)與角蛋白相關(guān)。經(jīng)比較分析CK18表達(dá)上調(diào)最為明顯（圖1，2）。

2.2 7402細(xì)胞HE染色細(xì)胞形態(tài)改變:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞死亡明顯，殘留細(xì)胞體積變大，變圓，濃染，可見空泡變性，胞漿疏松（圖3A）；對照組細(xì)胞大多呈梭形，核仁明顯（圖3B）。

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色細(xì)胞形態(tài)改變:實(shí)驗(yàn)組CK18的表達(dá)增強(qiáng)且分布不均，主要集中在核膜周圍胞質(zhì)中，部分呈環(huán)狀分布（圖3C）；對照組CK18的表達(dá)在胞漿和胞膜均勻分布（圖3D）。

2.4 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變:細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)明顯變化，未加藥組胞漿內(nèi)可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、豐富的核糖體及大量溶酶體等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，部分細(xì)胞內(nèi)含脂滴，細(xì)胞表面絨毛明顯，偶見變性的線粒體、凋亡癌細(xì)胞。加藥組細(xì)胞變圓，細(xì)胞表面絨毛減少，大多數(shù)細(xì)胞器變性，可見空泡變性（圖4A），滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體減少，溶酶體增多，胞漿內(nèi)微絲結(jié)構(gòu)增多，并多分布于細(xì)胞核周圍（圖4B）。部分細(xì)胞胞漿濃縮，電子密度增高，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)不清楚，核固縮，脂滴相對減少，并可見凋亡小體（圖4C）。

3 討 論

蛋白質(zhì)組學(xué)是后基因組研究中最主要的部分，主要從兩個(gè)方面加以研究，一方面是“完全”蛋白質(zhì)組學(xué)，目的是檢測一種細(xì)胞或一種組織內(nèi)基因組表達(dá)的所有蛋白質(zhì)，另一方面是“差異”蛋白質(zhì)組學(xué)，目的是尋找和篩選任何有意義的因素引起的兩個(gè)樣本之間的差異蛋白質(zhì)譜，同時(shí)對所獲得的某些蛋白進(jìn)行功能分析及定性[5]。常用的蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)包括雙向電泳技術(shù)、生物質(zhì)譜技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)等[6]。有學(xué)者利用雙向凝膠電泳等蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行肝癌的蛋白分析，發(fā)現(xiàn)61個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)點(diǎn)，158個(gè)下調(diào)點(diǎn)，其中71個(gè)基因產(chǎn)物已得到證實(shí)，并首次發(fā)現(xiàn)在肝癌組織樣本中，熱激蛋白70、90和核糖核蛋白C1、C2的過表達(dá)，這些都為尋找肝癌的潛在蛋白標(biāo)志物提供了依據(jù)[7]。目前，在肝癌生物治療的基礎(chǔ)和臨床研究中，基因治療已經(jīng)顯示出了良好的發(fā)展前景，而自殺基因治療為主要采用的手段之一[8]。ADV-TK/GCV自殺基因系統(tǒng)又稱重組腺病毒介導(dǎo)胸昔激酶/更昔洛韋系統(tǒng)，ADV-TK編碼區(qū)共1 128個(gè)核苷酸，編碼的胸苷激酶為376氨基酸構(gòu)成的蛋白產(chǎn)物，能催化GCV生成三磷酸更昔洛韋，在DNA復(fù)制時(shí)與脫氧三磷酸鳥苷競爭性的插入DNA，抑制腫瘤細(xì)胞DNA鏈的延伸，并且抑制DNA聚合酶活性，從而殺死腫瘤細(xì)胞[9]。但該系統(tǒng)影響腫瘤細(xì)胞生長代謝、運(yùn)動(dòng)等的相關(guān)機(jī)制和其所引起的基因及其蛋白質(zhì)的表達(dá)變化報(bào)道并不多。

本研究利用肽質(zhì)量指紋圖譜和雙向電泳分析法進(jìn)行ADV-TK/GCV系統(tǒng)對人肝癌細(xì)胞7402、7721及癌旁肝細(xì)胞7701作用前后的差異蛋白檢測，共分析出40個(gè)有明顯差異的點(diǎn)，其中包括多種最有可能蛋白的上調(diào)與下調(diào)，對基因治療的敏感株7402而言，有11個(gè)點(diǎn)上調(diào)明顯，14個(gè)點(diǎn)下調(diào)明顯。差異點(diǎn)主要集中在與物質(zhì)能量代謝的酶類相關(guān)的蛋白質(zhì)組和與細(xì)胞骨架相關(guān)的蛋白質(zhì)組。如下調(diào)差異蛋白點(diǎn)所覆蓋的蛋白質(zhì)組可能包括丙酮酸激酶、磷酸甘油酸變位酶及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等與腫瘤物質(zhì)能量代謝相關(guān)的酶類。除了下調(diào)的與細(xì)胞物質(zhì)能量代謝相關(guān)的酶類外，上調(diào)的細(xì)胞骨架成分中，最有可能相對分子質(zhì)量的蛋白以角蛋白為主要代表，本研究重點(diǎn)觀察了CK18的表達(dá)特點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示,CK18在對照組癌旁肝細(xì)胞株7701、對基因治療不敏感的肝癌細(xì)胞株7721及處理前的敏感株7402中均為少量表達(dá)，而ADV-TK/GCV處理后，只有敏感株7402檢測出CK18表達(dá)明顯增高。本研究結(jié)果提示敏感株7402的CK18表達(dá)增高與ADV-TK/GCV處理有關(guān)，關(guān)于CK18的功能，一般認(rèn)為CK18屬于相對分子質(zhì)量較小的Ⅰ型細(xì)胞角蛋白，作為細(xì)胞骨架蛋白中間微絲的一種，主要由腺上皮表達(dá)，目前被廣泛應(yīng)用于腫瘤的診斷。正常肝臟組織即有CK18的表達(dá)，CK18被認(rèn)為是成熟肝細(xì)胞的標(biāo)志[10]。有學(xué)者[11]證實(shí)，正常肝組織與肝硬化組織中CK18表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而肝細(xì)胞癌組織CK18表達(dá)增高與肝硬化組織中CK18表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示CK18參與了從肝硬化到肝細(xì)胞癌的癌變過程，認(rèn)為它也是肝細(xì)胞癌的一個(gè)潛在的評價(jià)指標(biāo)。

本研究結(jié)果表明,經(jīng)ADV-TK/GCV處理后肝癌細(xì)胞形態(tài)明顯改變，細(xì)胞增大變圓，胞漿空泡變性，免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示CK18陽性表達(dá)物在未處理組為胞漿彌散分布，處理后陽性產(chǎn)物多聚集在核周。同時(shí)，電鏡下處理組細(xì)胞可見微絲在核周圍分布明顯增多，作為細(xì)胞骨架的微絲結(jié)構(gòu)與細(xì)胞生長、運(yùn)動(dòng)等關(guān)系密切，因此ADV-TK/GCV自殺基因系統(tǒng)處理后CK18的表達(dá)及微絲分布的變化可能與肝癌細(xì)胞的生長代謝、運(yùn)動(dòng)及遷移有關(guān)。

同時(shí)，在細(xì)胞凋亡研究中發(fā)現(xiàn)，CK18被Casepase裂解于2個(gè)靶點(diǎn)（Asp238和Asp396），由此分解的片段在血液中的濃度穩(wěn)定，且對細(xì)胞凋亡有高度的特異性[12]。凋亡通過內(nèi)外兩條通路發(fā)生，最終通過各種酶的激活，從而降解細(xì)胞成分，其中就包括中間微絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的水解斷裂及CK18的釋放入血，在肝細(xì)胞凋亡的過程中，CK18由于蛋白水解酶Caspase的作用釋放入血，因此被認(rèn)為是肝細(xì)胞凋亡的指標(biāo)[13]，目前臨床已利用CK18的血清學(xué)檢測觀察治療效果。本研究發(fā)現(xiàn),ADV-TK/GCV處理后肝癌細(xì)胞7402的CK18表達(dá)上調(diào)及分布改變的同時(shí)，電鏡下可見凋亡小體增多。

本研究從蛋白質(zhì)水平證實(shí)了ADV-TK/GCV自殺基因系統(tǒng)作用前后肝癌細(xì)胞7402在物質(zhì)能量代謝類蛋白及細(xì)胞骨架類蛋白表達(dá)上出現(xiàn)明顯差異，并從病理形態(tài)學(xué)水平加以驗(yàn)證，但這種差異是通過何種途徑實(shí)現(xiàn)的還需繼續(xù)深入研究。（本文圖見封二）

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（本文編輯：趙麗潔）

DETECTIONOFDIFFERENCEPROTEINANDOBSERVATIONOFPATHOMORPHISMONHUMANHEPATOMACARCINOMACELLLINE7402,7721ANDADJACENTLIVERCELL7701BEFOREANDAFTERADV-TK/GCVTREATMENT

ZHUYanpei1,LINing2,TAOYing1,WANGJue1,YUWei3,DAIJie1*
（1.CenterforClinicalPathology,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China;2.DepartmentofHepatobiliarySurgery,BeijingYou’anHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China；3.DepartmentofPathology,BeijingAnzhenHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100029,China）

ObjectiveTodetectetheexpressionofthedifferenceproteinsofthehumanhepatomacarcinomacellline7402，7721andadjacentlivercell7701beforeandafterthetreatmentoftheadenovirus-thymidinekinase/gancyclovir（ADV-TK/GCV）system,furtherelucidatingthemechanismofthesuicidegenesystemADV-TK/GCVonhepatomacells.MethodsPeptidemassfingerprinting（PMF）andtwo-dimensionalelectrophoresisanalysiswereusedtotesttheexpressionofthedifferenceproteinsofthehumanhepatomacelllines7402,7721andtheadjacentlivercellline7701beforeandafterthetreatmentoftheADV-TK/GCVsystem;moreover,weobservedthecellpathologicalmorphologychangesafterthetreatmentwithHemateinEosin（HE）,oneoftheroutinemethodsofpathology.Wealsousedtheelectron-microscopytodetecttheexpressionport,distributionandquantityofcytokeratin18 （CK18）ofdosinggroupandcontrolgroupwithimmunohistochemistry.Results7721and7701weresensitivetoADV-TK/GCVsystem.Theexpressionofmanyproteinsofthehumanhepatomacelllines7402,exhibiteddifferencesafterthedisposalmethodofsuicidegenedrugs,theexpressionofCK18wasupregulatedobviouslybycomparativeanalysis.CellularmorphologychangedsignificantlybyHE.Cellsinthecontrolgroupweremostlyspindle-shapedandnucleoliwereobvious,whilemostcellsindosinggroupdied.Thevolumeofresidualcellwassmall,round,andhyperchromatic.Electronmicroscopyobservationsshowedthatthecontrolabundantorganelles,accidentallysawcellapoptosis.Dosinggroupofcellorganellewereoedematousobviously,microfilamentincreasedandthroughoutaroundthenucleus,apoptosisphenomenonwasobvious.TheimmunocytochemistryshowedthattheexpressionofCK18ofthecontrolgroupwasequallydistributedinthecytoplasmandcellmembrane,buttheexpressionofCK18ofthetreatmentgroupincreasedandwasunevendistribution,mainlyconcentratedinthemembranesurroundingthecytoplasm,someofwhichwerecirculardistribution.ConclusionAfterthesuicidegenesystemADV-TK/GCVplayedarole,proteinexpressionofthesensitiveline7402showeddifferences,whichsuggestedtheexpressionofCK18upregulatedmemorably,thedistributionpresenteddifferencesandcausedchangesinthemorphology.

liverneoplasms;differentiallyexpressedproteins;keratins

2013-10-30；

2014-01-16

國家科技部傳染病防治重大專項(xiàng)（2008ZX10002-026）

朱艷培（1987-），女，云南楚雄人，首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)碩士研究生，從事肝癌自殺基因治療研究。

R735.7

A

1007-3205（2014）05-0546-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.05.017

*通訊作者