大腦中動脈線栓法腦缺血模型制作的改進及經驗探討

盧 英，蔡光先*，譚 琥，鄧叔華，易 健，劉柏炎

（1.湖南中醫藥大學2011級碩士研究生班，湖南 長沙 410208；

2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院省部共建教育部重點實驗室，湖南 長沙 410007；

3.益陽醫學高等?？茖W校，湖南 益陽 413000）

大腦中動脈線栓法腦缺血模型制作的改進及經驗探討

盧 英1，蔡光先2*，譚 琥2，鄧叔華1，易 健2，劉柏炎3

（1.湖南中醫藥大學2011級碩士研究生班，湖南 長沙 410208；

2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院省部共建教育部重點實驗室，湖南 長沙 410007；

3.益陽醫學高等?？茖W校，湖南 益陽 413000）

目前局灶性腦缺血動物模型最常用的方法是大腦中動脈線栓法（MCAO），但該方法仍存在技術要求高、模型差異性大、動物死亡率高等缺陷。因此，如何建立穩定、可靠、重復性高的MCAO動物模型成為我們亟需解決的問題。從實驗動物、麻醉藥物、栓線的選擇，手術流程、術后護理等多個方面進行探討，以期提高MCAO腦缺血動物模型的成功率。

大腦中動脈線栓法；腦缺血；模型大鼠

局灶性腦缺血動物模型的制作方法眾多，其中大腦中動脈線栓法 （Middle cerebral artery occlusion，MCAO）以其不開顱、易操作、損害小及對生理指標影響小等優點受到學者們的高度重視，廣泛應用于藥效的評價及腦缺血-再灌注多方面的研究[1]。目前國內所用MCAO操作流程均參照Longa等的方法，但該操作流程技術要求高，不同的人造出的模型差異性大，動物死亡率高，大大降低了它的可比性和實用性。本實驗室近10年來使用MCAO大鼠模型進行腦缺血實驗研究，完成了多個973，國家自然基金，省、廳級課題，手術成功率達80%以上。因此，本文結合文獻查閱的方法，將MCAO模型制備遇到的問題及解決方法做一介紹，供同仁參考。

1 實驗動物（Experimental Animal）

MCAO動物模型最初主要用大型動物作為研究對象[2]，但大動物購買費用高，梗死灶變化較大，不利于實驗研究。因此，目前MCAO模型所選動物絕大部分是嚙齒類動物[3]。在嚙齒類動物中，大鼠的腦血管與人類的腦血管具有相似性，且其有較強的抗感染力、成本低、種系內純合性好等特點，被廣泛用于腦缺血實驗。國內實驗室所用大鼠主要有SD和Wistar兩個品系。相比較而言，SD大鼠可見恒定的頂顳皮質梗死灶，梗死體積大于Wistar大鼠，變異較小，缺血半暗帶所占體積明顯小于Wistar大鼠[4]，因此多首選SD大鼠。另外，由于不同體質量大鼠大腦中動脈（middle cerebral artery，MCA）的粗細及長短差距較大，這在很大程度上影響著模型的成功率。目前多數文獻認為大鼠體質量應該控制在 250～ 350 g之間[5]，但本實驗室認為以控制在260～300 g之間為宜。理由有三:第一，大鼠手術前禁食12 h后，體質量會減輕14～15 g；第二，禁食后體質量小于250 g的大鼠，對麻醉藥耐受差，魚線難以插入，且術后大鼠易死亡；第三，禁食后體質量大于290 g，甚至300 g以上的大鼠側支循環能在較短時間內建立完善，神經功能恢復快，不利于藥物效果的評價。

2 麻醉劑（Anesthetics）

腦缺血手術中大鼠需要在全身麻醉的情況下進行，但全身麻醉對動物的血液循環、呼吸、腦代謝等均具有較大的影響，甚至直接導致動物死亡，因此需選擇合適的麻醉劑。實驗所用麻醉劑分為氣體吸入麻醉和腹腔注射麻醉，但氣體麻醉設備要求高、作用時間短，故未被國內大多數人采用。水合氯醛和戊巴比妥鈉均通過腹腔注射，操作簡單，麻醉時間適中，是目前國內主要的麻醉劑。有研究[6]認為水合氯醛對胃腸道及呼吸道影響較大，動物蘇醒后狀態不佳，而戊巴比妥鈉較少出現上述現象；但有學者[7]認為巴比妥類對腦缺氧有保護作用，故不應該用于腦缺血實驗。實驗中發現，當水合氯醛過量時大鼠會出現口、鼻分泌物增多等現象，只要掌握好劑量即可避免這種現象。因此，推薦使用10%的水合氯醛麻醉，但需注意以下幾點:第一，配水合氯醛時稱量要嚴格；第二，現配現用；第三，嚴格按動物體質量計算藥量，體質量在260～300 g的大鼠，麻醉量應在0.35 mL/100 g的基礎上加0.1 mL效果最佳，這時的大鼠全身松軟，不能自主運動，生命體征平穩，能耐受整個手術過程；第四，若大鼠未完全麻醉，可根據大鼠麻醉程度加量，即大鼠能夠綁于鼠板上，但分離筋膜時有掙扎，可加0.1～0.2 mL；備皮時掙扎加0.2～0.3 mL；能夠爬或不能綁在鼠板上，加0.5 mL。

3 栓線（Plug Line）

目前多數實驗室用釣魚線做栓線，但魚線有直徑和硬度的區別。一般實驗人員只考慮魚線大小是否合適，并未考慮魚線硬度與模型成功之間的關系。關云謙等[8]研究發現，相同直徑的魚線，隨著魚線硬度的增加，蛛網膜下腔出血的發生率呈明顯上升趨勢，模型成功率明顯下降。因此，相同直徑的魚線，以硬度稍軟的為佳，但需要注意的是魚線過軟不利于插入MCA中。在魚線直徑的選擇上，本實驗室認為禁食后體質量在250～290 g的大鼠，魚線選擇直徑為0.25 mm的較為合適。

手術前魚線的處理相當重要，Longa等的方法與栓線法創始者Koizumi等的方法，主要差別是栓線頭的處理不同:Koizumi等在栓線一端涂布硅膠，而Longa等則是將栓線一端在火焰上燒灼處一個鈍頭[9]。雖然二者的處理方法不同，但都是為了減少栓線頭對血管的損傷，而Shimamura[10]證實，處理過的栓線確實能夠提高大鼠的存活率、減少梗死體積變異以及產生一致性較高的神經功能評分。目前國內對魚線頭的處理上，主要有以下三種方法[3]:（1）直接將頭端用酒精燈或電烙鐵燙成光滑而膨大的球形；（2）在魚線表面涂以化學物質，如硅膠、石蠟等；（3）將頭端燙圓后再涂上0.1%左旋多聚賴氨酸。本實驗室則是將魚線頭直接在熾熱的白熾燈表面摩擦，使線頭光滑，不會劃傷血管即可。線頭處理好后的魚線需要用黑色油性記號筆做標記，以便手術過程中節省時間。之后將魚線放入75%乙醇中浸泡至少1 h，再用生理鹽水沖洗干凈。這時直接將魚線放入干凈的培養皿中保存，但也有人會將魚線再用肝素浸泡，以防止魚線插入MCA后引起血栓形成。魚線是否有必要用肝素浸泡，目前尚無專門的文獻報道。但是需要指出的是，肝素浸泡后的魚線會變直，這不利于魚線插入MCA。

4 手術流程（Surgical Process）

Longa的操作方法有諸多不合理的地方，因此目前多采用改良的Longa方法。首先，切口位置的選擇，楊贊章等[11]認為頸旁切口出血較正中切口少，視野暴露充分；先雄斌等[4]進一步指出切口應在頸前正中線外側約0.5 cm處，切口長約2.5 cm。其次，傳統方法是撕裂胸骨舌骨肌并暴露氣管，從氣管旁分離左側頸總動脈 （common carotid artery，CCA）等，這種方法一方面會損傷氣管，影響大鼠呼吸，另一方面不利于術后傷口的恢復。因此，現在多采用鈍性分離胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌間的肌間隙，暴露CCA和迷走神經，從而避免傷及氣管。另外楊贊章等[11]主張在暴露的切口處滴上少許利多卡因，以減輕對迷走神經和氣管的刺激。再次，在頸外動脈（External carotid artery，ECA）、頸內動脈（Internal Carotid artery，ICA）分支的處理上也與Longa的方法有很大差異。如吳培要等[12]分離出ICA和枕動脈，用燒灼法離斷枕動脈，在ECA下穿線2根，線一離CCA分叉處3 mm結扎不剪斷，線二不結扎以供牽拉備用，動脈夾夾閉CCA、ICA，于2根線之間的ECA剪一切口，將栓線由此口插入，進入ICA；崔利德等[13]則在ECA的起始處穿線并結扎該動脈，然后在CCA的近心端穿線并結扎該動脈，并留一線備用，用動脈夾夾閉CCA的末端，然后在CCA近動脈夾處用眼科剪剪一小口將栓線插入，接著用備用線系住，防止出血，放開動脈夾插線。本實驗室認為吳氏等的方法需要分離出一定長度的ECA，且要用燒灼法切斷ECA和枕動脈，很容易傷及ICA及周圍神經，且延長手術時間，增加手術風險；而崔氏等的方法與本實驗室的相似，但也有不同之處。本實驗室在結扎ECA后，用1個動脈夾夾住ICA，且盡可能遠離三岔口處，1個動脈夾夾住CCA，且盡可能遠離三岔口處，用穿線貼著動脈夾結扎CCA（勿剪斷，備用），松開動脈夾。在CCA上稍遠離三岔口的位置用眼科剪剪一小口將栓線插入ICA內，此時松開ICA上的動脈夾，同時用一手拉緊CCA上的結扎線，防止動脈夾松開后ICA出血。最后，將栓線繼續插入，直到栓線標記處達到三岔口處停止，此時會感到有輕微阻力，然后迅速用穿線將ICA結扎。在此過程中，需要特別注意的是ICA上的唯一分支——翼腭動脈 （Pterygopalatine artery，PPA），若魚線只插進10 mm就有明顯阻力，則提示魚線插入了PPA。對于新手來說這是經常會碰到的情況，且多次調整方向后仍會插入其中，這是手術失敗的最常見原因。因此，Woitzik J等[14]提出可通過事先結扎PPA的方法來解決這個問題。但這種方法不可取，因為PPA位置較深，結扎PPA需要繼續沿ICA分離肌肉，但該處有迷走神經及其他小神經和小血管經過，分離該處肌肉將會增加出血風險和神經損傷風險，且不利于大鼠術后的恢復。

本實驗室操作流程:在大鼠兩前肢連線稍上方與前正中線旁開0.5～1 cm交叉處，用手術剪向大鼠嘴部方向剪一適當口子 （長度根據操作者手術熟練度而定，一般在2.5 cm以內）。然后用手術彎鑷鈍性分離胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌間的肌間隙，此時視野下可見由前斜角肌、中斜角肌、后斜角肌等頸深肌匯聚成的三角形區域，CCA就在該三角區下面靠內側部位，沿著這些肌間隙繼續鈍性分離，即可見一搏動的紅色血管，此即CCA，在其外側緊靠著迷走神經 （有時迷走神經也可貼在CCA上面），用鑷子將CCA和迷走神經游離出來，并使迷走神經置于CCA的外側，在CCA上穿一結扎線。沿著CCA繼續游離出ICA和ECA，并在ICA和ECA上各穿一結扎線。需要注意的是在CCA、ICA和ECA交叉處有一小血管即枕動脈，在游離ECA和ICA時枕動脈容易破裂出血，游離時需謹慎。將游離的ECA結扎，結扎處盡可能靠近三岔口處，以防止插魚線時魚線進入ECA。之后用1動脈夾夾閉ICA，再用另一動脈夾夾閉CCA近心端，然后結扎CCA。在CCA上用眼科剪剪一小口，將魚線插入到ICA后松開ICA上的動脈夾，繼續將魚線插入，直至達到MCA。結扎ICA，完成手術。

5 術后護理（Postoperative Care）

術后大鼠放于裝有干凈墊料的鼠籠，取側臥位，并用墊料蓋住大鼠身體及創口，有條件的也可在鼠籠中墊雙層干燥的棉布，再用干燥手術鋪巾蓋于大鼠上，在鼠籠內放一些飼料，飲用水為1%蔗糖水，并使動物房保持在26℃。待大鼠完全清醒后開始做神經功能評分。另外，為了防止術后感染，檢測指標與炎癥無關時可考慮術后前3 d每天腹腔注射青霉素，按4萬U/只大鼠。

6 模型評價（Model Evaluation）

模型評價方法有多種，如神經功能損傷行為學評價、腦組織干濕重、腦組織TTC染色、HE染色和CT灌注掃描等。其中腦組織干濕重和腦組織TTC染色能較直觀地了解大鼠腦缺血情況，但需要一定的儀器設備和試劑，花費大，且需要處死大鼠，增加實驗大鼠數量；CT灌注掃描是近年來隨著影像學的發展而出現的，CT灌注掃描對梗死模型進行篩選可進一步降低由模型變異引起的實驗誤差，為實驗研究提供實時可靠信息[15-16]。但該方法實驗儀器要求更高，花費更大，不適合普通實驗研究。神經功能損傷行為學評價常用的方法有姿勢反射實驗、走木條實驗、肢體放置實驗及抓握-牽拉實驗[17]。其中姿勢反射實驗最為常用[18]。姿勢反射實驗主要用于評估永久性或暫時性MCAO模型中的皮質梗死，評估對側肢體感覺運動及行為能力。目前多用Bederson方法或其改良方法。

本實驗室在長期的實驗觀察中發現，Bederson方法及其改良方法并不適用于長期的神經功能損傷評估，尤其是在術后2周后很難判斷大鼠功能損傷分數。因此，在使用神經功能損傷評分時，在Bederson評分法的基礎上，加用了Ayelet Levy評分法[19]。術后大鼠清醒后將進行Bederson評分，將分數為0分和4分的大鼠剔除掉；Ayelet Levy評分則用于評估大鼠在各個時間點的神經功能恢復情況。

7 總結（Summary）

總之，MCAO腦缺血模型制作需注意以下幾點:（1）大鼠體質量應在260～300 g之間；（2）麻醉藥物可選擇10%水合氯醛，現配現用，麻醉量應在0.35 mL/100 g的基礎上加減0.1 mL效果最佳；（3）手術操作規范化，注意術中血管分離方法及魚線插入深度；（4）注意術后大鼠護理；（5）選擇合理的模型評價標準，尤其是神經功能損傷評分標準。這樣制作的模型更加穩定、可靠和重復性高，使實驗更具有可比性、可重復性。

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（本文編輯 匡靜之）

Experience and improvement of preparation of the cerebral ischemia model by string-fastenings method for middle cerebral artery occlusion

LU Ying1,CAI Guangχian2,TAN Hu2,DENG Shuhua1,YI Jian2,LIU Boyan3
(1.2011 Class of master degree candidate,Hunan University of CM, Changsha,Hunan 410208,China；
2.Key Laboratory of Ministry of Education,First Affiliated Hospital,Hunan University of CM, Changsha,Hunan 410007,China；
3.Yiyang Medical College,Yiyang,Hunan 413000,China)

The most common method for establishment of animal model of focal cerebral ischemia isthestring-fasteningsmethod formiddle cerebralartery occlusion,butthere are severaldefectsforthe method such asdemanding technics,marked differencesin model animals,high mortality.Therefore,establishing a stable,reliable,and reproducible animal model of focal cerebral ischemia has become an urgent problem.The choice of animal,anesthetic drugs and bolt lines,surgical procedures and postoperative care are discussed in this article in order to improve the success rate of focal cerebral ischemia model by the suture of middle cerebral artery.

the string-fastenings method for middle cerebral artery occlusion;cerebral ischemia;model rat

R743；Q95-33

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.01.002.006.04

2013－10－30

國家自然科學基金（81072939，81273989）；湖南省高校創新平臺開放基金（09K056，10K048，12K089）。

盧 英，女，在讀碩士研究生，主要從事中醫藥防治腦血管病研究。

*蔡光先，男，教授，博士研究生導師，E-mail:lby1203@sina.com。