色素上皮衍生因子抑制糖尿病視網膜血管病變的研究新進展

李亞永，江新利(綜述)，馬會杰，劉 巖(審校)(1.河北醫科大學第三醫院內分泌科，河北 石家莊 050051；2.河北省石家莊市第一醫院(西院)內科，河北 石家莊 050000；.河北醫科大學第三醫院眼科，河北 石家莊 050051；.河北醫科大學基礎醫學院生理學教研室，河北 石家莊 050017)

·綜述·

色素上皮衍生因子抑制糖尿病視網膜血管病變的研究新進展

李亞永1，2，江新利3(綜述)，馬會杰4，劉 巖1*(審校)
(1.河北醫科大學第三醫院內分泌科，河北 石家莊 050051；2.河北省石家莊市第一醫院(西院)內科，河北 石家莊 050000；3.河北醫科大學第三醫院眼科，河北 石家莊 050051；4.河北醫科大學基礎醫學院生理學教研室，河北 石家莊 050017)

糖尿病視網膜病變；色素上皮源性因子；信號傳導

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病最嚴重微血管并發癥之一，其發病率、致盲率隨著糖尿病病程的延長而增加。其基本病理改變包括早期血-視網膜屏障破壞、視網膜微血管瘤形成、出血、滲出，以及晚期新生血管形成和增殖性病變。色素上皮源性因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)是目前發現的最有效的內源性新生血管抑制因子，同時具有神經營養及神經保護功能。PEDF作為DR疾病發展過程的一個保護性因子，其作用機制一直是目前研究的熱點。現就PEDF對DR保護作用研究的新進展以及分子生物學機制進行綜述。

1 PEDF概述

1989年Tombran-Tink等[1]在胎兒視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium,RPE)培養液中首次提取一種具有促神經生長分化的細胞因子，即PEDF。PEDF相對分子質量為50 000，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑基因家族，但不具備蛋白酶抑制活性。人類PEDF基因位于染色體17p13，長度約為16kb，由8個外顯子和7個內含子構成，具有高度保守性。

研究表明，PEDF具有神經營養、神經保護、抗腫瘤、抗新生血管以及改善血管通透性等多種作用。PEDF廣泛存在于腫瘤、神經組織、肝、睪丸、卵巢、胎盤甚至毛囊中[2-3]，培養的內皮細胞、成骨細胞也可分泌PEDF[4]。在眼球中,RPE、角膜以及睫狀上皮等多種細胞均可合成和分泌PEDF[5-6]。正常情況下眼球內PEDF的含量很低，玻璃體內PEDF濃度約為1～2mg/L，約為房水中PEDF的10倍，但為感光細胞間質中PEDF的1/10[7]。

2 PEDF在糖尿病視網膜病變中的作用

PEDF作為DR的一個保護性因子，其作用貫穿于DR病程的全過程，其作用如下。

2.1 抗氧化應激及改善血管通透性：DR的最早期病理改變為視網膜微血管周細胞喪失及功能障礙、血管通透性增加。糖尿病時持續高血糖狀態導致體內多種蛋白質非酶糖基化并形成晚期糖基化終末產物(advanced glycation endproducts，AGEs)，AGEs可誘導還原型輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶活性，導致Akt激酶在Ser473的磷酸化，促使活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)產生，并能減少視網膜血管內皮細胞鈣黏蛋白(VE-cadherin)的表達，從而導致血管滲透性增加[7]。而PEDF可以減少NADPH膜亞基p22phox磷酸化，抑制NADPH氧化酶活性，從而減少AGEs誘導的ROS產生[8]，同時PEDF還可增加緊密連接蛋白(zona occludens-1,ZO-1)的表達，改善內皮細胞的屏障作用，從而抑制AGEs導致的血管通透性增加。但在糖尿病時，AGEs也抑制視網膜周細胞內PEDF mRNA的表達，造成PEDF生成減少，對視網膜病變的保護減少。Yoshida等[9]對鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導的1型糖尿病大鼠的研究中發現，糖尿病大鼠視網膜PEDF水平下降，Müller細胞內膠質纖維酸性蛋白(gliad fibrilary acidicprotein,GFAP)表達增加，視網膜8-羥基脫氧鳥苷、p22phox和VEGF水平以及NADPH氧化酶活性增加，而這些變化可在靜脈內注射PEDF4周后得以改善。

2.2 抗炎作用：慢性炎癥反應在糖尿病視網膜病變的發生、發展中起著一定作用。有研究[10]發現，增殖性糖尿病視網膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)患者玻璃體和STZ誘導的糖尿病大鼠視網膜的白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)含量增加，導致白細胞聚集、血管滲透性增加和內皮細胞形態改變。玻璃體內注射PEDF可以降低視網膜的一些促炎癥因子，如單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)以及細胞間黏附因子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的含量[11]。反之，視網膜Müller細胞PEDF表達下降可以導致TNF-α分泌增多[12]。因此，PEDF可作為一種內源性抗炎癥因子對糖尿病視網膜病變發揮保護作用。

2.3 PEDF抑制糖尿病視網膜新生血管形成：Dawson等[13]在1999年首次發現PEDF具有抑制血管增生的作用，這是維持角膜、玻璃體等組織無血管結構的主要原因。正常情況下，機體內血管生成促進因子和抑制因子之間保持平衡。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前已知的功能最強的新生血管形成促進因子，具有增加微血管通透性、促使內皮細胞外基質溶解、內皮細胞增殖移行及誘導血管生成等多種功能。正常情況下，在眼部視網膜的周細胞、視網膜色素上皮細胞和內皮細胞均可產生較低水平VEGF，這對維持眼部血管的完整是必要的，然而過度表達將促進血管的增殖。PEDF是目前發現的最強的抗新生血管因子。Ogata等[11]發現，DR患者玻璃體液中PEDF的含量較正常人明顯減少，而作為促進血管增殖的VEGF則呈現相反的改變。Duh等[14]發現提高PEDF濃度能抑制小鼠視網膜新生血管形成。細胞培養亦證明,PEDF可抑制VEGF誘導的血管內皮細胞增殖與遷移。糖尿病視網膜局部PEDF水平的減少則削弱了這種保護性作用，為DR發生創造條件或促使DR發生、發展及惡化。

目前的研究發現，PEDF對VEGF的抑制作用可能是通過以下幾個信號途徑實現的。

2.3.1 誘導細胞凋亡：Fas是TNF受體超家族成員，是一個跨膜受體，可與跨膜蛋白FasL結合，激活半胱氨酸蛋白酶(caspase)依賴的凋亡聯級反應，從而導致細胞凋亡。FasL/Fas是最為常見的細胞凋亡途徑。Volpert等[15]研究發現，PEDF的抗血管生成作用部分是通過FasL/Fas途徑誘導內皮細胞凋亡實現的。靜止期的血管內皮細胞FasL表達很低，且周圍細胞抗凋亡蛋白如Bcl-2的濃度較高，從而阻止細胞凋亡的發生[16]。PEDF可以誘導內皮細胞FasL表達，導致細胞凋亡增加，從而抑制新生血管的形成。VEGF等新生血管刺激因子誘導產生的新生血管內皮細胞表達Fas受體，且易受PEDF作用而導致內皮細胞凋亡。Stellmach等[17]的研究發現，PEDF通過Fasl/Fas受體系統辨別新形成的血管內皮細胞和先前已存在的血管內皮細胞。可見，PEDF可特異性地抑制新生血管的增殖。此外，PEDF還可以通過激活人胞漿型磷脂酶A2(ytosolic phospholipase A2,cPLA2)、p38促分裂原活化蛋白(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)、脂質過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPAR-γ)以及p53等基因的表達誘導內皮細胞的凋亡[18]。

2.3.2 JAK2/STAT3途徑:JAKs/STATs信號途徑是人們在研究干擾素(interferon,IFN)-α、-γ研究中發現的，JAKs家族是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，有JAK1、JAK2、JAK3和TYK2等4個成員。STATs是JAKs激酶的底物，哺乳動物細胞STAT家族成員主要包括STAT1～6。JAKs激酶活化后導致胞漿中以單體存在的STATs分子磷酸化，形成二聚體，從而使其與受體解離，轉移至核內并結合于啟動子區相關序列，調控相關基因表達，導致血管內皮細胞增殖。研究[19-20]發現，VEGF為JAK2/STAT3信號途徑的下游靶基因，多種促血管增殖因子都可以通過激活JAK2/STAT3進而增加VEGF表達。Zheng等[21]發現，高糖可以誘導牛視網膜毛細血管內皮細胞VEGF的表達增加以及JAK2/STAT3的磷酸化，而PEDF可以通過抑制JAK2/STAT3途徑降低VEGF表達。

2.3.3 PI3K/Akt信號途徑：PI3K/Akt信號通路是細胞內信號轉導途徑，在細胞的增殖、凋亡、轉化以及腫瘤的發生中發揮重要作用。VEGF作為刺激因子可以導致PI3K的激活，PI3K被激活后，在細胞膜上生成第二信使PIPa，PIPa與細胞內含有PH結構域(pleckstrin homology domain)的信號蛋白Akt和磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(phosphoinositide dependent kinase l，PDKl)結合，促使PDKl磷酸化Akt蛋白的Ser308，導致Akt的活化。有研究[22]發現，PI3K/Akt可能參與了高糖狀態下內皮細胞遷移、增殖以及血管功能紊亂。PEDF可以有效地減弱VEGF介導的PI3K/Akt磷酸化，通過抑制PI3K/Akt信號途徑抑制VEGF誘導的細胞遷移和體外RECs管形成[23]，從而抑制新生血管形成。

2.3.4 Src信號途徑：Src家族激酶(The Src family of protein tyrosine kinases)由BLK、LYN、FYN、LCK、HCK、FGR、YRK、YES和c-Src9個成員組成。Src廣泛存在于多種組織細胞中，參與絲裂原活化蛋白激酶信號途徑、FAK通路、STATs通路、PI3K-Akt通路以及Na+-K+-ATP酶等多種信號途徑的反應過程。Src被激活后可作為許多生化級聯反應的關鍵點，將細胞外產生的信號傳入胞內或者調控細胞內各分子間的信號傳遞，在細胞黏附、細胞增殖、調節血管生成的過程中發揮重要作用[24]。在VEGF誘導的血管生成過程中，Src激酶不僅可以保護血管內皮細胞免于凋亡，還參與了VEGF誘導的內皮細胞的遷移以及血管通透性增加過程[24]。同時，PEDF可通過Src途徑抑制視網膜周細胞的凋亡。這些結果表明，PEDF可能通過Src依賴的途徑抑制VEGF介導的血管通透性及視網膜血管內皮細胞的新生。

2.3.5 Wnt途徑：Wnt信號途徑是一種極其保守的細胞內信號轉導途徑，參與調節血管形成、炎癥、纖維化等多種病理生理過程。Frizzled(Fz)家族是Wnt蛋白的膜上受體，與低密度脂蛋白受體相關蛋白(low density-lipoprotein receptor-related proteins 6,LRP6)形成Fz-LRP6二聚體，在Wnt信號途徑中發揮重要作用。Park等[25]發現PEDF是一個新的Wnt信號途徑的抑制因子，通過局部轉基因使小鼠視網膜PEDF高表達和玻璃體注射PEDF蛋白都可以減弱視網膜缺血誘導的Wnt信號途徑，而通過小干擾RNA(small interfering,siRNA)使PEDF表達降低和PEDF敲除均可以使Wnt信號途徑激活。目前的研究認為，PEDF可以同LRP6結合，抑制Wnt誘導的Fz-LRP6二聚體的形成，從而抑制Wnt信號途徑，進而阻斷Wnt信號在DR病變中的作用。

3 PEDF生物制品在DR治療中的應用

PEDF是抑制眼內新生血管生成的強有力因子，同時也是一種神經營養因子。因此，PEDF生物制劑為預防和治療糖尿病視網膜病變提供了新的思路。但PEDF相對分子質量大、穩定性差、半衰期短，且全身應用PEDF制劑有可能干擾機體血管再生的整體調節，產生不良反應，故合成具有生物活性的PEDF多肽片段并局部應用是目前研究的重點。Longeras等[26]合成了具有34個氨基酸殘基的PEDF片段(PED-34)，于體外實驗發現PEDF-34可以抑制牛視網膜毛細血管內皮細胞增殖，誘導其凋亡。Liu等[27]構建了2種PEDF多肽P60和P78，將其作為眼藥水治療糖尿病模型小鼠，結果顯示，雖然P60和P78可一定程度降低血管滲漏，并提高ZO-1蛋白的表達，但由于眼藥水的靶向運輸能力不足，治療效果尚不令人滿意。眼內PEDF轉染在治療眼血管增生模型上也取得了一定療效。Campochiaro等[28]在治療年齡相關性黃斑變性的臨床試驗中，將患者玻璃體內注射攜帶人PEDF基因的腺病毒載體，發現該載體具有長效抑制新生血管形成的作用。Kuo等[29]則將攜帶PEDF基因的質粒注射于大鼠結膜下，同樣達到長效抑制新生血管形成的作用。但更為簡單有效的治療方法仍在進一步的研究中。

4 結 論

DR是一種嚴重的糖尿病微血管并發癥，PEDF由于其抗炎、抗氧化以及強大的抑制病理性新生血管生成作用而在DR中備受關注，其內在機制以及相關的信號途徑也隨著相關研究的進展而日益更新，為DR的發病以及治療提供了更多新的思路。

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(本文編輯：許卓文)

2013-12-23；

2014-03-06

河北省醫學科學研究重點課題計劃(20100356)

李亞永(1976-)，男，河北高邑人，河北省石家莊市第一醫院主治醫師，醫學學士，從事內科臨床和基礎研究。

*通訊作者。E-mail:liuyanjiangcn@hotmail.com

R587.26

A

1007-3205(2014)11-1353-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.11.040