家兔下腔靜脈血栓模型建立的實驗研究

吳大勇 張文艷 陳江紅 邊艷珠 胡玉敬

肺動脈血栓栓塞(pulmonary thromboembolism，PTE)和深靜脈血栓形成(deep venous thrombosis，DVT)是靜脈血栓栓塞(venous thromboembolism，VTE)的兩種臨床表現，具有相同的易患因素［1］。PTE的病死率高，嚴重危害人類健康。DVT是PTE的主要血栓來源。近端深靜脈存在血栓的患者中，約50%患者伴有臨床無癥狀的PTE［2］。70%的PTE患者在下肢深靜脈發現血栓［3］。DVT的早期診斷及有效治療對預防PTE發生具有重要意義。DVT診斷及治療的動物實驗研究離不開靜脈血栓模型，靜脈血栓動物模型是DVT實驗研究的關鍵一環。靜脈血管內引入異物，通過異物啟動凝血過程，可在異物表面附著形成血栓;異物能夠導致血流淤滯，局部血液形成渦流，促進凝血;同時異物在靜脈血管內損傷血管內膜，暴露膠原組織，啟動內源性凝血過程促進血栓形成［4］。本實驗選用家兔下腔靜脈，對利用異物法建立下腔靜脈血栓模型進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級新西蘭家兔30只，體重2.0～2.5 kg，雌雄不限，購自河北醫科大學實驗動物中心，合格證編號:1009032。3%戊巴比妥鈉注射液河北醫科大學藥學院惠贈。青霉素購于石家莊制藥廠。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組:將30只實驗兔分為血栓組25只，對照組5只。血栓組建立下腔靜脈血栓模型，對照組僅進行造模術相同的手術過程，但不建立血栓模型。

1.2.2 實驗動物麻醉:由實驗兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉，注射劑量為1.0～0.3 ml/kg，麻醉成功后，仰臥位四肢伸展固定于手術臺。

1.2.3 血栓組下腔靜脈血栓造模方法:實驗兔右側腹備皮，沿腹直肌右外側線切開皮膚長約4～6 cm切口，逐層鈍性分離腹壁肌肉、腹膜。入腹腔后將腸管部分移出，用0.9%氯化鈉溶液浸濕紗布覆蓋腸管，充分暴露右腎下極水平以下下腔靜脈。將自制U形銅絲夾于右腎下極水平包繞下腔靜脈，長約3 cm直徑約3 mm的自制單股螺旋銅絲向心方向穿刺入下腔靜脈，止血后，將銅絲夾收緊使夾子縫隙約2 mm左右。回納腸管，0.9%氯化鈉溶液沖洗腹腔，逐層縫合腹膜、肌肉、皮膚。手術完畢后于實驗兔臀部肌內注射80萬U青霉素。家兔術后清潔環境飼養。

1.2.4 對照組手術方法:對照組進行與血栓組相同的手術過程，只是不在下腔靜脈內穿刺置入自制螺旋銅絲，及在下腔靜脈不放置自制U形銅絲夾。

1.2.5 解剖:血栓組與對照組均于手術后1 d，注射致死量戊巴比妥鈉處死實驗兔，解剖實驗兔，血栓組觀察血栓形成情況，對照組觀察下腔靜脈情況。

1.2.6 病理:血栓組處死動物后取血栓，0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，紗布粘干，立即至于甲醛溶液中固定，后血栓標本經石蠟包埋，切片，行蘇木精-伊紅(HE)染色。

2 結果

血栓組25只實驗兔造模術后均存活，一般情況良好。造模術后1 d處死實驗兔解剖后，所有25只實驗兔下腔靜脈管壁完好，未見破裂出血。23只實驗兔下腔靜脈內肉眼可見血栓形成(圖1)，紅色血栓與白色血栓沿螺旋銅絲相間附著(圖2)，下腔靜脈回流尚通暢，造模成功率92%(23/25)。2只實驗兔未觀察到下腔靜脈血栓形成，下腔靜脈回流通暢，系由于自制U形銅絲夾脫落，螺旋銅絲沿下腔靜脈隨血流上行嵌頓于右心房。

對照組5只實驗兔術后均存活，一般情況良好。術后1 d處死實驗兔解剖后觀察，可見下腔靜脈均回流通暢，下腔靜脈內未見血栓形成(圖1)。

血栓組血栓病理證實均為新鮮混合血栓(圖2)，紅色血栓與白色血栓間或存在，病理切片經HE染色，顯微鏡下見淡紅色珊瑚狀血小板小梁，小梁間纖維素網內包含大量紅細胞，血小板小梁邊緣有較多中性粒細胞粘附。

圖1 血栓組與對照組解剖后下腔靜脈照片

圖2 血栓大體標本與病理照片

3 討論

DVT是血液在深靜脈內異常凝集導致的靜脈血液回流障礙性疾病，靜脈血栓脫落阻塞肺動脈便引起PTE，PTE嚴重者影響患者生活質量甚至導致死亡。DVT是臨床多發的一種疾患，主要成因為靜脈血管壁損傷、血流緩慢和血液高凝狀態，常繼發于長時間靜坐、長期臥床、肢體制動、大手術創傷后或晚期腫瘤患者［5］。對DVT診斷或治療的研究對于預防PTE具有重要意義，靜脈血栓動物模型的建立是對DVT診斷或治療進行實驗研究的基礎。

研究報道中血栓模型的常用造模方法有三種。(1)通過損傷血管內膜暴露內膜下膠原激活凝血過程［6-8］。常見方法為在DSA下將導管穿刺插入血管，通過抽拉導絲或球囊來損傷血管內膜，此方法內膜損傷效果好，但需用到DSA機及需要導管介入操作技術，對于一般實驗小組較難實現。另也可手術暴露深靜脈利用血管鉗夾壓靜脈血管來損傷血管內膜［9，10］，但通過血管外加壓損傷血管內膜的效果差。(2)人為制造血管局部血流淤滯導致凝血［11］。常見方法為手術暴露靜脈血管利用手術縫線結扎血管，造成局部血液淤滯。血液淤滯形成的血栓多為紅色血栓，人類形成的靜脈血栓早期及中期多為混合血栓，只有在混合血栓阻塞血管后，在血栓尾端才形成紅色血栓［12］。張鵬等［13］利用導管介入技術通過球囊加壓阻塞血管，建立的犬下肢深靜脈血栓模型，血栓病理顯示以紅色血栓為主。(3)通過血管內置入異物啟動凝血過程。目前已有多篇報道［14］通過導管介入技術，將螺旋銅絲等異物置入靜脈血管建立血栓模型的報道。Wei等［15］利用導管將自制螺旋銅絲送入犬股靜脈，成功建立了股靜脈血栓模型。上述方法需利用DSA機及需要介入操作技術，一般科研人員較難實現。

本研究通過手術暴露下腔靜脈，將自制螺旋銅絲穿刺置入下腔靜脈，螺旋銅絲為異物激活凝血過程，也導致局部血流緩慢，另螺旋銅絲刺激損傷局部血管黏膜，啟動內源性凝血過程，促進血栓形成。于螺旋銅絲近心端下腔靜脈血管放置自制U形銅絲夾，固定螺旋銅絲，同時起到部分阻斷血流，導致局部血流瘀滯的作用，也利于血栓形成。該方法具有較高的成功率，實驗中成功建立下腔靜脈血栓模型23只，成功率92%(23/25)。造模術后1 d，實驗兔下腔靜脈內螺旋銅絲可見紅白相間沿銅絲分布的混合血栓。HE染色病理證實了血栓均為混合血栓。

文獻報道中常用于造模的動物有犬、家兔及大鼠。犬的血管較粗，容易操作，但價格昂貴;大鼠價格低廉，但血管較細，不容易操作，手術或介入方法都難度較大;家兔的下腔靜脈較粗，且價格適中，大樣本量的實驗是較合適的選擇。

本方法造模成功率高，血栓病理符合深靜脈血栓特點，所建立靜脈血栓模型可以用于靜脈血栓的影像診斷、溶栓治療及病理生理等研究，本方法無需借助DSA等大型儀器設備，也未利用導管介入技術等高難度操作，一般的科研工作人員較易獨立完成。

1 Torbicki A，Perrier A，Konstantinides S，et al.Guidelines on the diagnosis and management of acute pulmonary embolism:the Task Force for the Diagnosisand Management of Acute Pulmonary Embolism of the European Society of Cardiology(ESC).Eur Heart J，2008，29:2276-2315.

2 Moser KM，Fedullo PF，Littejohn JK，et al.Frequent asymptomatic pulmonary embolism in patients with deep venous thrombosis.JAMA，1994，271:223-225.

3 Kearon C.Natural history of venous thromboembolism.Circulation，2003，107(23 Suppl.1):122-130.

4 Drffler-Melly J，Schwarte LA，Ince C，et al.Mouse models of focal arterial and venous thrombosis.Basic Res Cardiol，2000，95:503-509.

5 李小強，王深明.深靜脈血栓形成的診斷和治療指南(第2版).中華外科雜志，2012，50:611-614.

6 Konishi H，Katoh Y，Takaya N，et al.Platelets activated by collagen through immunoreceptor tyrosine-based activation motif play pivotal role in initiation and generation of neointimal hyperplasia after vascular injury.Circulation，2002，105:912-916.

7 Massberg S，Gawaz M，Gruner S，et al.A crucial role of glycoprote in VI for platelet recruitment to the injured arterial wall in vivo.J Exp Med，2003，197:41-49.

8 賈支俊，申景濤，郭萬華，等.99Tcm標重組H-AnnexinV在動物血栓顯像中的研究.中華核醫學雜志，2007，27:291-294.

9 Massberg S，Brand K，Gruner S，et al.A critical role of platelet adhesion in the initiation of atherosclerotic lesion formation.J Exp Med，2002，196:887-896.

10 Gruner S，Prostredna M，Aktas B，et al.Antiglycoprotein VI treatment severely compromises hemostasis in mice with reduced alpha2beta1 levels or concomitant aspirin therapy.Circulation，2004，110:2946-2951.

11 Trerotola SO，McLennan G，Davidson D，et al.Preclinical in vivo testing of the Arrow-Trerotola percutaneous thrombolytic device for venous thrombosis.J Vasc Interv Radiol，2001，12:95-103.

12 Furie B，Furie BC.In vivo thrombus formation.J Thromb Haemostasis，2007，5(Suppl.1):12-17.

13 張鵬，施海彬，劉圣，等.犬下肢深靜脈血栓模型的實驗研究.介入放射學雜志，2006，15:299-302.

14 何嘉，方緯，王峰，等.99Tcm-DMP444肺動脈血栓與下肢深靜脈血栓顯像的實驗研究.中華核醫學與分子影像雜志，2012，32:59-62.

15 Wei Fang，Jia He，Young-Seung Kim，et al.Evaluation of 99mTc-Labeled Cyclic RGD Peptide with a PEG4 Linker for Thrombosis Imaging:Comparison with DMP444.Bioconjugate Chemistry，2011，22:1715-1722.