載神經生長因子納米柔性脂質體制備及穩定性研究

管晨峰 路偉 張開禮 郭見 潘一峰 黃國棟

神經生長因子(nerve growth factor，NGF)在損傷神經再生和功能修復過程中發揮重要作用。然而，NGF難以通過血腦屏障，使其在給藥的途徑和方式上存在技術上的難題。納米柔性脂質體具有高度的變形性，它能穿過直徑為其1/10的小孔。本研究采用薄膜-超聲法制備載NGF納米柔性脂質體，并對制備條件和穩定性進行研究。

1 材料與方法

1.1 儀器RE-52旋轉蒸發器(上海青浦滬西儀器廠);WH-2微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠);超聲破碎乳化儀;SHZ-Ⅲ型循環水真空泵(上海亞榮生化儀器廠);Zetasizer激光粒度分析儀(英國馬爾文公司)。

1.2 主要試劑 葡聚糖凝膠G-50(上海伯奧生物科技有限公司);卵磷脂、膽固醇、膽酸鈉(國藥集團化學試劑有限公司);NGF(廈門北大之路生物工程有限公司)。

1.3 載NGF納米柔性脂質體的制備 定量稱取卵磷脂、膽固醇、NGF于圓底燒瓶中，加入10 ml氯仿-甲醇復合溶劑于混合儀上充分溶解后，于37℃恒溫水浴中旋轉減壓蒸發去除有機溶劑，形成均勻類脂薄膜，以氮氣吹干殘余溶劑。再加入含有定量膽酸鈉的水和介質溶液10 ml至燒瓶中，旋轉洗膜1 h，使脂質膜充分溶脹水化，得到脂質體混懸液。將上述脂質體混懸液置于冰水浴中探針式間斷超聲，室溫靜置后用0.2 μm微孔濾膜過濾除去超聲時探頭所釋放的金屬顆粒等雜質。氮氣密封，4℃冷藏保存。

1.4 載NGF納米柔性脂質體包封率測定 取適量的載NGF納米柔性脂質體，加5%Tri-ton X-100乙醇溶液2 ml破乳，再加入5 ml磷酸鹽緩沖液充分混勻，萃取，靜置，Elissa法測定NGF含量。包封率=總NGF量-游離NGF量/總NGF量×100%。

1.5 載NGF納米柔性脂質體粒徑檢測 加樣槍吸取適量脂質體樣品溶液，注入到激光粒度分析儀的石英測量池和毛細管小池中，進行粒徑檢測。

1.6 統計學分析 應用SPSS 11.5統計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 制備溫度的影響 在20～50℃范圍對制備溫度進行了篩選。結果表明，30℃時，制備的納米脂質體包封率最高。見表1。

表1 制備溫度對包封率的影響±s

表1 制備溫度對包封率的影響±s

20℃30℃40℃50℃包封率(%)40.24±0.2261.52±0.4354.26±0.4633.52±0.27項目

2.2 pH值對包封率的影響 配制pH值分別為6.0，6.5，7.0，7.5，8.0的緩沖液，以它們作為水相介質，制備載NGF納米柔性脂質體。pH值為7.0時，制備的納米脂質體包封率最高。見表2。

表2 pH值對包封率的影響±s

表2 pH值對包封率的影響±s

8.0包封率(%)37.04±0.4441.26±0.3760.13±0.62 50.14±0.4項目pH值6.0pH值6.5pH值7.0pH值7.5pH值932.71±0.68

2.3 磷脂濃度對包封率的影響 考察磷脂的濃度分別為20、30、40、50 mg/ml時，磷脂濃度對藥物包封率的影響。磷脂濃度對藥物的包封率影響較大。磷脂濃度增加，包封率上升，當磷脂濃度達到40 mg/ml時，包封率變化不多。見表3。

表3 磷脂濃度對包封率的影響±s

表3 磷脂濃度對包封率的影響±s

20 mg/ml30 mg/ml40 mg/ml50 mg/ml包封率(%)23.61±0.1442.30±0.6357.86±0.7260.05±0.67項目

2.4 膽固醇與磷脂的比例對包封率的影響NGF藥量固定，改變膽固醇的濃度，使膽固醇與磷脂的比例為1∶10，1∶8，1∶6，1∶4，1∶2。隨著膽固醇濃度的增加，包封率也相應的增加，當比值達到1∶4時，包封率趨于穩定。見表4。

表4 膽固醇與磷脂的比例對包封率的影響±s

表4 膽固醇與磷脂的比例對包封率的影響±s

1∶2包封率(%)22.16±0.2035.36±0.2540.72±0.5462.02±0.6項目 膽固醇與磷脂比1∶10膽固醇與磷脂比1∶8膽固醇與磷脂比1∶6膽固醇與磷脂比1∶4膽固醇與磷脂比365.30±0.62

2.5 載NGF納米柔性脂質體穩定性觀測 在室溫條件下，30 d內載NGF納米柔性脂質平均粒徑無顯著改變。同時，在4℃冰箱條件下保存12個月，上述指標的檢測結果與保存前相似。見表5。

表5 載NGF納米柔性脂質體穩定性觀測±s

表5 載NGF納米柔性脂質體穩定性觀測±s

室溫4℃下保存時間(月)項目12平均粒徑(nm)64.31±0.8362.17±0.6460.64±0.7264.3±0.83 0 d15 d30 d 06 59.58±0.4958.72±0.56

3 討論

NGF作為現在臨床上應用比較普遍的體液調節因子之一，廣泛的分布于中樞神經及周圍神經系統中。它通過促進神經系統的發育，維持神經元的生長、存活、分化，并影響突觸的可塑性。病理狀態下，NGF可抑制神經元的死亡，加強自由基的清除，促進神經元功能的恢復，達到保護神經元的目的。然而，由于NGF屬大分子蛋白質，正常情況下難以通過血腦屏障，限制其臨床應用［1-4］。

柔性脂質體是指在脂質體的雙分子層中加入不同的柔軟劑使脂質體具有優越的柔順性和變形性，易于攜帶藥物通過微孔道，而且，柔性脂質體對藥物的包封率高于普通脂質體，其穩定性也遠遠大于普通脂質體。納米級的柔性脂質體則具有更高的穿透效率［5-9］。

影響脂質體中藥物包封率有多種因素，如:溫度、溶液pH、磷脂濃度、膽固醇與磷脂的比例等，本文較系統地考察了各影響因素對神經生長因子納米柔性脂質體包封率的影響及其穩定性。

試驗結果表明，制備載NGF納米柔性脂質體的最適溫度為30℃;pH值為7.0時，制備的納米脂質體包封率最高。磷脂濃度增加，包封率上升，適宜濃度為40 mg/ml;磷脂與膽固醇相互間隔定向排列，形成雙分子層，是共同構成脂質體的基礎物質，本文的研究顯示，膽固醇與磷脂適宜比例為1∶4。

對載NGF納米柔性脂質體穩定性的研究表明，其性質穩定，室溫保存30 d、4℃冰箱12個月，其粒徑無明顯變化。

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