促紅細胞生成素對急性心肌缺血再灌注后大鼠心肌凋亡基因表達影響的實驗研究

康利鴿 何雪輝 田春鳳 李昕 劉蘭英

研究表明，促紅細胞生成素(EPO)可對心肌損傷產生保護作用，并可抑制心室重構，但其確切的機制尚不清除［1，2］。本實驗建立大鼠心肌缺血再灌注模型，觀察EPO對急性心肌缺血再灌注心肌凋忘基因表達的影響，探討EPO的心臟保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性Sprague Dawley大鼠36只，清潔極，12～15周齡，體重210～260 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供，按清潔極大鼠的要求飼養，自由進食水。

1.2 方法 通過阻斷左冠狀動脈前降支血流建立缺血再灌注模型。大鼠稱重，經10%水合氯醛麻醉(3.0 ml/kg腹腔內注射)。經口氣管插管接小動物呼吸機，潮氣量約為30 ml，通氣頻率90次/min。去前胸正中切口，在3～4肋間進入胸腔，分離心包，從劍突下方向胸腔方向從兩側胸壁后方向上方適度擠壓，使心臟跳出胸腔，在右心室流出道與左心房之間，據主動脈根部2 mm處用絲線(6-0)穿過左冠狀動脈前降支，用線管法阻斷冠脈血流。阻斷后顯示左心室壁變白，并出現室壁變白，心電圖I、avL導聯S-T段明顯抬高(＞1 mV)，表明阻斷成功，45 min后，松開絲線實施再灌注，保留絲線，逐層縫合，自主呼吸平穩后，撤掉呼吸機，拔出氣管插管。假手術組(Sham組)只穿線繞過冠狀動脈前降支而不阻斷血流。術后大鼠保溫，單籠放置，待清醒后再次稱重，編號，按組分籠飼養。

1.3 分組36只大鼠隨即分為3組，每組12只:(1)假手術組(Sham組):0.9%氯化鈉溶液1 ml，直接腹腔注射，1次/d，共3 d。(2)缺血再灌注組(IR組):0.9%氯化鈉溶液腹腔注射，1次/d，手術前連續3 d。(3)EOP組:EPO以3 000 U/kg直接腹腔注射，1次/d，手術前連續前3 d(濟脈欣，河北省石家莊市華北制藥廠生產)。

1.4 取材

1.4.1 染色:大鼠麻醉后迅速開胸，結扎保留絲線后，從下腔靜脈注入伊文氏藍2 ml。并靜脈注射10%氯化鉀溶液使心臟停跳于舒張末期，取出心臟，在4℃經高壓處理的DEPC水中洗去殘余血液，剪除多余血管及心房組織，分割左右心室(左心室包括室間隔部分)。藍染區為正常灌注區，非藍染區為缺血梗死期，非藍染區中的淡染區為邊緣區。

1.4.2 測定心肌梗死面積:自心尖部到結扎線沿心臟長軸將心肌組織分為5片，每片厚度1～2 mm，取第3片行TTC染色。將心肌組織切片放于2%TTC染色中，37℃溫浴30 min，取出后清水沖洗，白色部分為梗死區域。梗死面積(%)=TTC染色梗死區面積∕伊文氏藍染色的缺血梗死區面積。

1.4.3 TTC染色:取材完畢后邊緣區心肌組織約100 mg，冰上操作。立即放入液氮速凍，于-80℃冰箱中保存，用于mRNA基因檢測，另取邊緣梗死區為150 mg左右兩塊，放入10%甲醛溶液中，4℃冰箱保存，用于HE染色及免疫組化染色。

1.4.4 免疫組化染色:Bcl-2、Bax、血管內皮生長因子(VEGF)蛋白在細胞漿及細胞核內表達，陽性反應均呈棕黃色或黃色。數據采集應用Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統，在相同的放大倍數下，每個切片計數10個視野，計算陽性染色算占面積。Bcl-2、Bax、VEGF以陽性細胞染色的平均光密度值(OD)表示抗原表達量。

1.5 用RT-PCR方法測定Bcl-2mRNA、BaxmRNA流程

1.5.1 主要儀器:美國PE公司Geneamp 9600型PCR儀，德國賀利氏公司RS-28高速低溫離心機，德國Gilson微量移液器，美國UVP公司UVP凝膠掃描系統，國產DYY-Ⅲ橋式電泳儀等。

1.5.2 主要試劑:RNA提取試劑Trizol Reagent(Invitrogen公司)，逆轉錄酶(AMV-RT)，核糖核酸酶抑制劑(RNasin)，dNTP、Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase)、隨機引物、瓊脂糖(agarose)均購自美國Promega公司。逆轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)流程如下。

1.5.3 目的基因引物的合成:引物序列依據文獻報道設計，由北京賽百盛基因技術有限公司合成。大鼠Bcl-2引物序列:PCR 7.02 bp上游引物:5’-CAAGAATGCAAAGCACATCC-3’編號1106-371;下游引物:5’-ATCCCAGCCTCCGTTATCC-3’編號1106-372;大鼠Bax引物序列:PCR 407 bp;上游引物:5’-GGCTGGCAAGGTCACTGTCT-3’編號1106-373;下游引物:5’-AGCCACAAAGATGGTCACTGTCT-3’編號1106-374;大鼠心肌組織總RNA提取:取組織100 mg，嚴格按說明書規定步驟提取總RNA英語Qyant一步法RT-PCR試劑盒進行目的基因PCR擴增。見表1。

PCR熱循環參數:β-actin和Bcl-2、Bax基因擴增條件為:50℃30 s，94℃2 min，然后94℃60 s，58℃60 s，65℃90 s(33個循環)，65℃延伸10 min。擴增目的片段長同時擴增鼠β-actin用作內參照。

1.5.4 RT-PCR產物半定量:取RT-PCR產物4 μl，加上樣緩沖液1 μl，在1.5%瓊脂糖凝膠(含EB)上電泳，80 V，45 min，用UVP凝膠圖像成像系統拍攝打印實驗結果，用凝膠圖像分析系統(Gel-Pro Analyzer Version 3.0)分析后果。以樣本顯示的灰度值與β-actin的灰度值之比作為樣本mRNA的相對表達量。

1.6 統計學分析 應用SPSS 10.0統計軟件，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心肌組織邊緣區HE染色形態學觀察 與Sham組比較，IR組48 h、2周可見結構被明顯破壞，心肌纖維水腫、溶解斷裂、壞死甚至融合成大片狀，膠原網絡破壞，心肌細胞間結締組織大量增多，可見炎性細胞浸潤和心肌纖維化等。與IR組比較，EPO組在48 h、2周時上述形態學改變均明顯減輕。

2.2 心肌梗死面積比較 與IR組比較，手術后24 h心肌梗死減少27.9%(43%對31%，P＜0.01)。

2.3 邊緣區Bcl-2、Bax和VEGF的表達 與IR組比較，EPO組Bcl-2蛋白表達在48 h、2周分別為27.7%、31.4%;Bax蛋白表達在48 h、2周均降低，分別降低為20.9%、18.0%(P＜0.01)。Bcl-2/Bax比值在個時間點均顯著增高(P＜0.05);與IR組比較，EPO組Bcl-2mRNA各時間點均顯著增高，BaxRNA各時間點均顯著下降(P＜0.01)。。EPO組VEGF蛋白表達在48 h、2周均增高，分別增高22.1%、21.4%(P＜0.05或 ＜0.01)。見表1～3。

表1 邊緣區Bcl-2與Bax的蛋白表達n=6，±s

表1 邊緣區Bcl-2與Bax的蛋白表達n=6，±s

組別Bcl-2蛋白表達48 h2周蛋白表達48 h2 Bax周Sham組0.13±0.0210.13±0.0200.13±0.0210.13±0.022 IR組0.07±0.0140.08±0.0160.23±0.0260.21±0.023 EPO組0.10±0.0170.11±0.0140.18±0.0170.17±0.016

表2 邊緣區Bcl-2與BaxmRNA的相對表達n=6，±s

表2 邊緣區Bcl-2與BaxmRNA的相對表達n=6，±s

組別Bcl-2mRNA 表達48 h2周表達48 h2 BaxmRNA周Sham組0.086±0.0110.87±0.0130.33±0.0260.32±0.024 IR組0.31±0.0210.50±0.0340.81±0.0220.67±0.021 EPO組0.51±0.0260.65±0.0340.72±0.390.62±0.020

表3 邊緣區VEGF的蛋白表達n=6，±s

表3 邊緣區VEGF的蛋白表達n=6，±s

組別48 h2周Sham組0.095±0.01670.098±0.0176 IR組0.114±0.01200.140±0.0189 EPO組0.139±0.01310.170±0.0163

3 討論

研究發現，EPO除了促進造血功能以外，還具有保護心血管內皮功能，如抗心肌細胞凋亡的作用。在培養的大鼠心肌細胞缺氧損傷試驗中發現，加入rhEPO的細胞凋亡率降低50%，證實EPO具有抗心肌細胞凋亡的作用［3，4］。本研究采用在體實驗的方法，腹腔注射EPO，觀察其抗凋亡的作用，其結果是EPO可在心肌損傷的早期和后期顯著抑制促凋亡基因的表達，并減少損傷后在其心肌梗死的面積。

心肌組織中，抗凋亡基因Bcl-2及促凋亡基因Bax是影響細胞凋亡非常重要的基因，抗凋亡基因與促凋亡基因的相對比較在決定存亡中起關鍵作用［5］。本研究顯示EPO對2個基因的影響從缺血再灌注損傷后24 h就發揮了明顯的調節作用，并一直持續到第2周，而且Bcl-2和Bax的蛋白表達也發生了相應變化。

VEGF是一種與血管生長有關的特異性生長因子。VEGF生理功能為誘導血管內皮細胞的增殖和遷徙等作用［6］。Yockman等［7］通過VEGF基因治療兔心肌梗死后發現能減少梗死面積，VEGF保護機制就是抑制細胞凋亡的同時，還可抑制p53、Fas、Bax蛋白的表達和增加Bcl-2的表達。本研究提示EPO可增加VEGF蛋白的表達，可能是EPO抗細胞凋亡的機制之一。

細胞凋亡在心肌缺血再灌注中起非常重要的作用，抑制缺血的邊緣區心肌組織的凋亡可有效減少心肌梗死面積，并影響以后心室重構的過程［8］，EPO可能通過抑制邊緣區心肌細胞凋亡，或(和)促進心肌血管新生減少心肌梗死面積。

1 劉焱，張文亮，李增新.氯沙坦和螺內酯及聯合應用對心肌梗死大鼠早期新生血管的影響.河北醫藥，2012，34:1455-1457.

2 Dong S，Cheng Y，Yang J，et al.MicroRNA Expression Signature and the Rolerof MicroRNA-21 in the Early Phase of Acute Myocardial Infarction.J Biol chem，2009，284:29514-29525.

3 Patel NS，Sharples EJ，Cuzzocrrea S，et al.Pretreatment with EPO reduces the injury and dysfunction caused by ischemia/reperfusion in the mouse kidney in vivo.Kidney Int，2004，66:983-989.

4 Calvillo L，Latini R，Kajstura J，et al.Recombinant human erythropoietin pretects the myocardium from ischemia-reperfusion injury and promotes beneficial renmodeling.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100:4802-4806.

5 Danial NN，Korsmeyer SJ.Cell death:Critical control points.C cell，2004，116:205-219.

6 Vincenti V，Cassano C，Rocchi M，et al.Assignment of the vascuar endothelial growth factor gene to human chromosome 6p21.3.Circulation，1996，93:1493-1495.

7 Yockman JW，Choi D，Whitten MG，et al.Polymeric gene delivery of ischemia-inducible VEGF significantly attenuates infarct size and apoptosis following myocardial infarct.Gene Therapy，2009，16:127-135.

8 Ruixing Y，Jiaquan L，JIE C，et al.Intravenous administration of vascular endothelial growth factor improves caediac performance and inhibits cardiomyocyte apoptosis.Growth Factors，2006，24:209-217.