小檗堿在Caco-2細胞單層模型中吸收和外排機制的研究

陳健龍， 張玉玲， 董 宇， 蔡廣知， 貢濟宇*， 崔翰明*

(1.長春中醫藥大學，吉林 長春 130117；2.中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053)

小檗堿又稱黃連素，是異喹啉生物堿，存在于小檗科等4個科10個屬的多種植物中[1]。在臨床上主要作為抗菌藥和清熱解毒藥，隨著研究不斷深入，發現其還具有調脂、抗腫瘤、降血糖等多方面的藥理作用[2]，文獻報道[3]小檗堿口服吸收差，生物利用度較低，但其口服吸收和轉運機制尚不明確。

Caco-2 細胞來源于人體結腸癌細胞，與人體同源性好；Caco-2(the humancolon carcinoma cell line)細胞模型是近十幾年來國外廣泛采用的一種藥物腸吸收的體外模型，與腸上皮近似，細胞內有藥物代謝酶，Caco-2細胞模型用于研究藥物吸收轉運比較簡便[4-5], 本實驗旨在利用Caco-2細胞模型研究小檗堿的轉運機制，同時考察其是否為P-糖蛋白的底物，為含有小檗堿的中藥復方吸收機制研究提供參考。

1 儀器和材料

Waters H-class超高效液相色譜儀(四元泵、自動進樣器、在線真空脫氣機、PDA檢測器)；RF-5301PC熒光分光光度計(日本島津公司)；HZS-H恒溫水浴振蕩器(哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司)；TranswellTM培養板(CorningCostar公司)；MSU225S-000-DU 1/100萬電子分析天平(德國塞多利股份公司)；MILLIPORE純水機(MILLIPORE公司，型號Q-POD)；HERAcell1501-CO2恒溫孵育箱(美國Thermo Forma公司)；DI-CJ-2ND-超凈工作臺(北京東聯哈爾儀器制造有限公司)；eclipse Ti-U-倒置相差顯微鏡(日本尼康公司)；CF16RX-Ⅱ-離心機(日本Hitachi公司)。

Caco-2細胞購于中國醫學科學院基礎醫學細胞中心；鹽酸小檗堿對照品(批號110713-200609 購自中國食品藥品檢定研究院)；DMEM高糖培養基和胎牛血清均購自于Gibco公司；非必須氨基酸購自于sigma公司；熒光素鈉(sigma公司，批號101170902)；普萘洛爾(sigma公司，批號101143426)；維拉帕米(sigma公司，批號1001211726)，乙腈、甲醇、乙酸銨、甲酸均為色譜純，其他試劑均為分析級。

2 方法

2.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(1.7 μm×2.1 mm×100 mm)，流動相乙腈-水(2 mmoL乙酸銨和0.05%甲酸，pH為3.20)=30∶70，體積流量為0.3 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長345 nm。

2.2 小檗堿、工具藥和抑制劑溶液的配制 精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，置于10 mL量瓶中，用Hanks溶液定容至刻度，搖勻，配制質量濃度為201.6 μg/mL的小檗堿對照品貯備液。

精密稱取普萘洛爾和熒光黃對照品適量，分別置于100 mL量瓶中，用Hanks溶液定容至刻度，搖勻，得普萘洛爾和熒光黃對照品貯備液分別為30.04 μg/mL和20.08 μg/mL。

精密稱取維拉帕米對照品適量，置于10 mL量瓶中，用Hanks溶液(含小檗堿30 μmol/L)定容至刻度，搖勻，配制質量濃度為45.46 μg/mL的維拉帕米對照品貯備液。

2.3 Caco-2細胞單層模型的建立 Caco-2細胞在37 ℃,含5% CO2,相對濕度為90%培養箱中培養。采用DMEM培養基,培養基中含10%FBS、1%非必需氨基酸、和1%青-鏈霉素。將細胞按50 000個/cm2接種到6孔Transwell培養板上,培養21d[6-7]。經過驗證，細胞形成緊密的單層后即可用于實驗。

2.4 線性關系 分別精密吸取一定量小檗堿對照品貯備液，用Hanks溶液稀釋，配制成質量濃度分別為20、50、100、200、500 ng/mL的系列對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，以峰面積(Y)為縱坐標，質量濃度(X)為橫坐標，進行線性回歸。

2.5 精密度、穩定性和回收率試驗考察

2.5.1 精密度試驗 分別取線性范圍內高、中、低3種不同質量濃度的對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續測定6次，連續測定3 d，記錄峰面積，計算分別日內和日間的精密度。

2.5.2 穩定性試驗 取中濃度對照品溶液，分別于1、2、3、4、5、6 d按“2.1”項色譜條件測定，記錄峰面積，計算小檗堿質量濃度的RSD。

2.5.3 回收率試驗 精密吸取一定量小檗堿對照品貯備液，用Hanks溶液稀釋定容，使小檗堿終質量濃度為150 ng/mL，重復試驗6次。然后按“2.1”項下的色譜條件測定，計算小檗堿的回收率。

2.6 檢測限和定量限 分別取質量濃度為5和15 ng/mL的小檗堿溶液進樣，根據S/N3和S/N10計算最低檢測限和最低定量限。

2.7 方法專屬性試驗 以Hanks溶液作為空白樣品，然后按“2.1”項下的色譜條件測定；將一定濃度的小檗堿溶液加到空白樣品中，依同法操作，分別得色譜圖1中A和B。

圖1 小檗堿的超高液相色譜圖

2.8 Caco-2細胞單層模型的驗證 按標準操作規程[8]，進行在 Caco-2 細胞單層模型上呈良好吸收轉運的陽性對照藥普萘洛爾和難吸收轉運陽性對照藥熒光黃的吸收轉運試驗。接種的 Caco-2細胞，在培養的第21天，在AP側加入質量濃度為30 μg/mL普萘洛爾或質量濃度為20 μg/mL熒光黃溶液0.5 mL，BL側加入空白Hank溶液1.5 mL，置于37 ℃水浴中，在60 min取BL側轉運液適量進行測定。熒光黃完全不被吸收，Papp應在5×10-7cm/s，檢測膜的完整性。普萘洛爾易于吸收，Papp應在1×10-5cm/s，檢測膜的單層性,同時測定細胞電阻值快速檢測細胞完整性和單層性。

2.9 小檗堿雙向轉運實驗 待TranswelTM培養板長到21 d時，測定細胞的電阻，選擇電阻大于350 Ω的用于轉運實驗。用預熱至37 ℃的Hanks溶液洗細胞兩次，最后一次放置在37 ℃培養箱中30 min后吸棄，然后將不同質量濃度的小檗堿溶液加在AP側或BL側為供給池，同時對應的BL側或AP側加空白的Hanks溶液，將TranswellTM培養板放在37 ℃，50 r/min的水浴鍋中，分別在30、60、90、120 min吸取0.1 mL或0.2 mL的接受液，同時補加等體積空白的Hanks溶液，每組平行3個復孔，按“2.1”項下的色譜條件測定。

2.10 P-gp抑制劑維拉帕米對小檗堿轉運的影響 Caco-2細胞在TranswellTM板中培養21 d后,測定細胞的電阻，選擇電阻大于350 Ω的用于轉運實驗。在AP側加入30 μmol/L小檗堿,其中一組含10 μmol/L維拉帕米,對照組不加維拉帕米,每組平行3份。置于轉速為50 r/min 37 ℃水浴恒溫振蕩器,分別在30、60、90、120 min吸取BL側的轉運液0.2 mL。在BL側進行相同操作收集AP側轉運液,按“2.1”項下的色譜條件測定。

2.11 數據分析 Caco-2細胞實驗表觀滲透系數的計數：

Papp=(dQ/dt)/AC

其中dQ/dt為接受藥物側待側藥物出現的速率(μg/min)，A為細胞單層表面積(cm2)，C為給藥側的初始藥物質量濃度。

3 實驗結果

3.1 方法學研究結果 在本研究應用的分析條件下,Hanks液中的其他物質不干擾小檗堿的測定。以峰面積(Y)為縱坐標，質量濃度(X)為橫坐標，進行線性回歸，得小檗堿回歸方程為：Y=73.991X-126.622 (r=0.999 4)，線性范圍：18.3～458 ng/mL；方法的高、中、低質量濃度的日內精密度分別為(1.71%、2.19%、5.33%)，日間精密度分別為(4.77%、6.92%、8.58%)，24 h穩定性的RSD分別為4.04%，均小于10%，回收率在96.94%～100.99%之間,見表1。定量限(S/N3)和檢測限(S/N10)分別為5.058 7和16.862 4 ng/mL。所建方法能滿足Caco-2細胞單層模型中Hanks液中小檗堿檢測的需要。

表1 回收試驗結果(n=6)

3.2 工具藥(普萘洛爾和熒光黃)在Caco-2細胞單層模型的轉運 實驗條件下,采用陽性藥物普萘洛爾和陰性藥物熒光黃鑒定Caco-2細胞單分子膜形成，Caco-2細胞培養在TranswellTM培養21d后，得到陽性對照藥普萘洛爾的Papp值為1.29×10-5cm/s,符合文獻報道值2.75×10-5cm/s[9]，陰性藥熒光黃的Papp值為5.17×10-7cm/s,符合文獻報道值5×10-7cm/s[10]，說明Caco-2細胞單分子膜形成，并在此時測量細胞膜的電阻，在之后的實驗中用此電阻值來判斷細胞是否形成單分子層。

3.3 小檗堿在Caco-2細胞單層模型轉運研究 生長在對數期的Caco-2細胞接種在TranswellTM培養板上，培養21 d，細胞的電阻350 Ω 可以用于轉運實驗研究。不同質量濃度小檗堿AP-BL、BL-AP累積透過量與時間的關系，見圖2。在小檗堿不同質量濃度的情況下，其BL-AP的Papp大于AP-BL的Papp，且比值大于1.5，小檗堿可能是P-gp糖蛋白的底物。

3.4 P-gp抑制劑維拉帕米對小檗堿轉運的影響 維拉帕米的加入量參考文獻[11]。加入P-gp抑制劑維拉帕米后對小檗堿的轉運量及Papp與對照組有所不同，結果見表3，圖3。加入抑制劑后小檗堿的表觀滲透系數明顯增加(P<0.05)，降低小檗堿的外排，進一步證明小檗堿受到P-糖蛋白的外排作用。

1.BL-AP轉運曲線 2.AP-BL為轉運曲線 1.Transport of basolateral to apical 2.Transport of apical to basolateral

表3 小檗堿與加入維拉帕米的表觀滲透系數

圖3 小檗堿與加入維拉帕米的表觀滲透系數

4 討論

Caco-2細胞來源于人類結腸癌細胞，具有與小腸上皮細胞相同的細胞極性和緊密連接，可以模仿小腸上皮吸收；該模型操作簡便、重復性較好，實驗條件比較容易控制，與動物實驗相比，培養細胞要比培養動物更省時、更經濟，是目前較理想的體外吸收模型，是闡明藥物吸收機制的有力工具[12]，本實驗建立的測定Hanks溶液中小檗堿的反相超高液相色譜方法，經專屬性、標準曲線、精密度、穩定性及回收率等方法學驗證，表明此分析方法具有靈敏、準確、快速的特點，所建方法能滿足Caco-2細胞單層模型中Hanks液中小檗堿檢測的需要。

在新藥研究和開發過程中藥物外排泵和轉運蛋白的作用也已成為促進藥物吸收和提高生物利用度的研究熱點。由于不同種類藥物外排泵和轉運蛋白在腸道上皮細胞存在于不同的位置，導致其功能作用也不同。因此可以利用轉運蛋白的生物學特性，對藥物進行結構修飾，通過增加其與促吸收蛋白的親和力而促進吸收。此外也可利用藥物外排泵底物結構修飾、底物與外排泵抑制劑的聯合用藥等方式，提高口服藥物的生物利用度[13]。

P-糖蛋白是一種跨膜糖蛋白，具有能量依賴性“藥泵”功能。有資料報道，復發和難治的白血病患者其P-gp表達較正常人增加。當藥物經細胞轉運途徑吸收時，P-gp泵成為藥物吸收的一個重要生理屏障，它能減少細胞吸收藥物，因此成為口服生物利用度低、波動大的一個重要影響因素[14]。

利用人小腸上皮Caco-2細胞單層來進行藥物小腸吸收的細胞水平實驗，現在已經成為一種預測藥物在人體小腸吸收以及研究藥物轉運機制的標準篩選工具。Caco-2細胞在TranswellTM培養板上培養，自發的分化出AP側與BL側，在AP側有高表達的P-gp。在轉運實驗中，4個不同質量濃度的小檗堿溶液在轉運實驗得到Papp沒有統計學差異(P>0.05)，說明小檗堿的吸收以被動擴散為主。藥物從基地側到頂端通透性與從頂端到基底端通透性有顯著性差異。不同質量濃度小檗堿其Papp(BL-AP)遠大于Papp(AP-BL),其比值在8～10之間，說明小檗堿更易由基底面到腸腔面，可能有外排泵參與轉運。P-gp是一種質膜糖蛋白，是多藥耐藥基因mdr1的產物，存在Caco-2細胞中，其功能是將藥物由BL側藥物逆向轉運至AP側，使藥物的吸收降低。加入P-gp抑制劑維拉帕米后，小檗堿的Papp(AP→BL)明顯增加，Papp(BL→AP)降低，說明聯用維拉帕米降低了小檗堿的外排，而使小檗堿的轉運增加，更進一步說明小檗堿是P-糖蛋白的底物。而外排的存在是導致小檗堿的口服吸收減少，口服生物利用度較低的原因。

參考文獻：

[1] Lu T，Liang Y，Song J，etal.Simultaneous determination of berberine and palmatine in rat plasma by HPLC-ESI-MS after oral administration of traditional Chinese medicinal preparation Huang-Lian-Jie-Du decoction and the pharmacokinetic application of the method[J].JPharmBiomedAnal，2006，40(5):1218.

[2] Abourashed E A, Khan I A. High-performance liquid chromatography determination of hydrastine and berberine in dietary supplements containing goldenseal[J].JPharmSci，2001,90(7):817-822.

[3] Huang S H, Long X Y, Yuan F,etal. Correlativity between solubility O/W partition coefficients of berbenine hydrochloride and intestinal absorption in rats in situ[J].ChinJModApplPharm, 2012, 29(3): 233-238.

[4] Yang H T，Wang G J． Caco-2 cell monolayers model and its application in pharmacy[J].ActaPharmSin，2000，35(10): 797-800.

[5] Liao S，Xie J W． Application of Caco-2 cell model in druginvitroresearch[J]．ChinJNewDrugs，2005，14(4) : 416-419.

[6] Samii A, Etminan M, Wiens M O,etal. NSAID use and the risk of Parkinson′s disease: systematic review and meta-ana-lysis of observational studies[J].DrugsAging, 2009, 26(9):769-779.

[7] 宋 麗，張 寧，徐德生.芍藥苷在Caco-2細胞模型中吸收機制的研究[J].中草藥，2008,39(1):41-44.

[8] 楊秀偉，楊曉達，王 瑩，等.中藥化學成分腸吸收研究中Caco-2細胞模型和標準規程的建立[J].中西醫結合學報，2007,5(6):634-641.

[9] Choi S Y,Ahn E M, Song M C,etal.InvitroGABA-transam-inase inhibitory compounds from the root of Angelica dahurica[J].PhytotherRes, 2005, 19(11):839-8451.

[10] 帕麗達·阿不力孜,叢媛媛,米仁沙·牙庫甫，等.Caco-2細胞體外吸收模型的建立及評估[J].亞太傳統醫藥，2011,7(4):6-8.

[11] 葛月賓，馬 燕，李衛中.大豆苷元在Caco-2細胞模型中的轉運和代謝[J].中草藥，2009,32(10):1563-1567.

[12] 楊秀偉，楊曉達，王 瑩，等.中藥化學成分腸吸收研究中Ca-co- 2 細胞模型和標準操作程序的建立[J].中西醫結合學報，2007，5(6) : 634.

[13] 王 平，劉 輝，孟憲麗等.藥物外排泵和轉運蛋白對口服藥物吸收影響的研究進展[J].中藥與臨床，2010,1(2):54-57.

[14] 王亞之, 歐喜笑, 鄭 穎.外排轉運體和代謝酶與黃酮的相互作用及其對黃酮腸吸收影響的研究進展[J].中草藥，2009，40(10):1659-1663.