穿心蓮內酯緩釋滴丸的制備及其體外釋放度

孟戎茜， 劉曉燕， 付玉佳

(太原工業學院化學與化工系，山西 太原 030008)

穿心蓮內酯是中藥穿心蓮的主要活性成分之一，具有祛熱解毒，消炎止痛之功效，因其對細菌性及病毒性上呼吸道感染和痢疾有特殊療效，被譽為天然抗生素[1]。近年來隨著研究的深入對其抗腫瘤以及免疫調節方面的研究也取得了較大的進展，并展現了誘人的抗腫瘤效果[2]。由于穿心蓮內酯難溶于水，口服吸收較差，生物利用度低，從而影響其療效，目前已上市的穿心蓮劑型主要為速釋劑型：注射劑、片劑、滴丸劑等，具有藥物釋放快、維持療效短等特點，然而隨著臨床研究發現，上述劑型由于釋藥過快易引發過敏反應及腎臟的損害作用等副作用[3-6]。

緩釋滴丸是基于緩控釋固體分散體技術并采用滴制法所制成，具有增加藥物溶解度和控制藥物釋放，提高生物利用度，減少服用次數和劑量等特點[7]。為此，本實驗采用固體分散體技術，即采用速釋性PEG6000和緩釋性固體分散體載體材料硬脂酸，制備出穿心蓮內酯緩釋滴丸，期望12 h服用一次，達到減小血藥濃度波動、提高患者依從性、增加藥物吸收的目的[8]，并為開發穿心蓮內酯的新制劑提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 DWJDW-III型實驗大丸機(煙臺開發區博森制藥機械有限公司)；TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；RC-8DS 型溶出度測試儀(天津市富蘭斯電子科貿有限公司)。

1.2 試藥 穿心蓮內酯對照品(純度98.7%，批號110797-201108供含量測定用，中國食品藥品檢定研究院)；穿心蓮內酯(純度98.6%，批號SP20130212，陜西森弗生物技術有限公司)；PEG6000(分析純，天津市光復精細化工研究所)；硬脂酸(分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司)；十二烷基硫酸鈉(分析純，北京中聯化工試劑廠)。

2 方法與結果

2.1 穿心蓮內酯測定方法的建立 采用紫外分光光度法，以甲醇作為溶劑，考察穿心蓮內酯緩釋滴丸中主藥穿心蓮內酯的測定方法，同時為正交試驗中載藥率的計算提供依據。

2.1.1 測定波長的選擇 精密稱取穿心蓮內酯對照品適量，用甲醇溶解，移置25 mL的量瓶中定容，即為對照品貯備溶液；精密吸取0.5 mL對照品貯備溶液置10 mL量瓶中，用甲醇定容即為對照品溶液。

精密稱取空白基質適量，用甲醇溶解，移置25 mL量瓶中定容，即為空白貯備液；照對照品溶液配制方法得到空白溶液。

分別精密吸取0.5 mL對照品溶液和0.5 mL空白溶液，置10 mL量瓶中，用甲醇定容，即得空白+對照品溶液。

取對照品溶液、空白溶液和空白+對照品溶液，以甲醇作為空白對照，照紫外-可見分光光度法(《中國藥典》2010版一部附錄VA)[9]在200～400 nm內進行波長掃描，結果見圖1～3。

由圖1可知穿心蓮內酯在224.5 nm處有最大吸收，由圖2可發現空白溶液在224.5 nm處有一定的吸收，但通過對比圖1～3可知，空白溶液+對照品溶液的吸收度為對照品溶液吸收度與空白溶液的吸收度的疊加，故測定穿心蓮內酯緩釋滴丸中藥物含量時，以空白溶液為對照，可消除基質對滴丸中藥物含量測定的干擾，故確定對穿心蓮內酯進行含量測定時所選取的波長為最大吸收波長224.5 nm。

圖1 對照品溶液紫外掃描圖

圖2 空白溶液紫外掃描圖

圖3 空白+對照品溶液紫外掃描圖

2.1.2 溶液的配制 精密稱取對照品10.3 mg置50 mL量瓶，用甲醇定容，即為穿心蓮內酯對照品貯備液(質量濃度為203.3 mg/L)。按預定處方藥物與基質(硬脂酸∶聚乙二醇6 000為1∶4)比例為1∶2制備緩釋滴丸，取穿心蓮內酯緩釋滴丸適量，研細，精密稱取細粉31.1 mg，用甲醇溶解，轉移置50 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，作為樣品貯備液。按預定處方比例制備空白滴丸，取空白滴丸適量，研細，精密稱取細粉20.5 mg，按上述操作制得空白儲備溶液。

2.1.3 線性關系 分別取穿心蓮內酯對照品貯備液0.8、0.6、0.5、0.4、0.2 mL置10 mL量瓶中，用甲醇定容，即為穿心蓮內酯-甲醇的對照品溶液。以甲醇作為空白對照，用紫外分光光度方法，在224.5 nm處測得不同質量濃度的對照品溶液的吸收度。結果表明，在4.07～16.27 mg/L質量濃度范圍內，與吸收度呈良好線性關系，線性方程為y=0.045x+0.006(r=0.992)。

2.1.4 重復性試驗 取穿心蓮內酯對照品貯備液1.25 mL置25 mL量瓶，用甲醇定容，用紫外分光光度方法在224.5 nm處重復測定5次，測得平均吸收度為0.4 676，RSD為0.126%<1%，表明該方法重復性良好。

2.1.5 穩定性試驗 取“2.1.4”項中所配制的對照品溶液，測定在0、2、4、6、8 h的吸收度，結果RSD為0.647%<1%，表明該方法至少在8 h內穩定性良好。

2.1.6 回收率試驗 分別精密吸取穿心蓮內酯對照品貯備液0.5 mL和穿心蓮內酯樣品貯備液0.5 mL置25 mL量瓶，用甲醇定容，平行配制6份；精密吸取空白液0.5 mL用甲醇定容至25 mL量瓶中，作為空白對照。在224.5 nm處測定其吸收度，計算回收率。結果平均回收率為87.25%，RSD為0.90%，表明該方法回收率高，準確度良好。

2.2 體外釋放度試驗方法的建立

2.2.1 釋放介質的選擇 分別以磷酸緩沖液(pH6.8)，0.6%十二烷基硫酸鈉溶液，0.9%十二烷基硫酸鈉溶液作為釋放介質，觀察緩釋滴丸中主藥在12 h內的釋藥情況，釋放度試驗結果表明：緩釋滴丸在磷酸緩沖液(pH6.8)、0.6%十二烷基硫酸鈉溶液和水三種介質中12 h釋藥不完全，而在0.9%十二烷基硫酸鈉溶液釋放介質中12 h可釋藥完全。

為了進一步考察不同溶劑對穿心蓮內酯溶解度的影響，測定穿心蓮內酯在水、磷酸緩沖液(pH6.8)以及0.6%，0.9%十二烷基硫酸鈉溶液中的溶解度，取500 mL錐形瓶，加入3g穿心蓮內酯原料藥與加熱至(36±0.5)℃的4種溶劑250 mL，用磁力攪拌器攪拌至飽和溶液，取續濾液測定穿心蓮內酯濃度，即為在該溫度條件下穿心蓮內酯在4種溶劑中的溶解度，分別為0.081、0.068、1.022、1.294 mg/mL。為了更好地模擬藥物在體內的釋放情況，藥物在釋放介質中的溶解度較大時更能符合漏槽條件[10]，綜合考慮選用0.9%十二烷基硫酸鈉為釋放介質。

2.2.2 線性關系 分別精密吸取上述對照品貯備液1、0.8、0.6、0.5、0.4 mL置10 mL量瓶中，再分別加入甲醇0、0.2、0.4、0.5、0.6 mL，用1.5%十二烷基硫酸鈉溶液定容，精密吸取1 mL甲醇至10 mL量瓶中用0.9%十二烷基硫酸鈉定容作為空白溶液。采用紫外分光光度法在224.5 nm處測定吸收度， 結果表明在8.13～20.33 mg/L質量濃度范圍內，與吸收度呈良好線性關系，線性方程為y=0.030 4x-0.028 1，r=0.997 2(n=5)。

2.2.3 重復性試驗 精密吸取對照品液0.8 mL，照“2.2.2”項中方法測定待測溶液的吸收度，重復測定6次，測得平均吸收度為0.468 3，計算可得RSD為0.402% <1%，故表明該方法重復性良好。

2.2.4 穩定性試驗 精密吸取對照品液0.8 mL，照“2.2.2”項中方法測定該溶液在0、2、4、6、8 h的吸收度，結果RSD為0.799%<1%，故該方法在8h內穩定性良好。

2.2.5 回收率試驗 分別精密吸取的穿心蓮內酯樣品液0.5 mL和對照品貯備液0.5 mL置25 mL量瓶中，用0.9%十二烷基硫酸鈉溶液定容，作為待測溶液，平行制備6份。精密吸取空白滴丸液1 mL置25 mL量瓶中，用1.5%十二烷基硫酸鈉溶液定容，作為空白對照溶液。采用紫外分光光度法，以空白溶液為對照，在224.5 nm處測定待測溶液的吸收度，計算回收率，結果平均回收率為88.50%， RSD為1.4%<2%，故該方法回收率良好。

2.2.6 體外釋放度的測定 采用《中國藥典》2010版二部附錄XC溶出度測定法中第1法(轉籃法)測定優選緩釋滴丸的體外累積釋放度。在6個溶出杯中加入250 mL經脫氣處理的溶出介質，溫度為(36±0.5) ℃，恒溫。取穿心蓮內酯滴丸6份，分別投入6個轉籃中，取空白滴丸投入轉籃中，并將轉籃固定在轉桿上。立即啟動旋轉并開始計時，經2、4、6、8、10、12 h取樣，每次吸取溶液5 mL，立即經0.45 μm微孔濾膜濾過，自取樣至濾過在30 s內完成，精密吸取續濾液3 mL置25 mL的量瓶內，再加入1 mL甲醇，用0.9%十二烷基硫酸鈉溶液定容。按上述操作配制空白溶液。在每次取樣完畢，需及時向操作容器中補充同溫度同濃度的十二烷基硫酸鈉溶液。以空白溶液為對照，采用紫外分光光度法，在224.5 nm波長處測定吸光度，計算累積釋放度。

2.3 緩釋滴丸的制備工藝研究 按比例精密稱取硬脂酸與PEG6000適量，混合研勻，加熱熔融，精密稱取穿心蓮內酯粉末加至已熔化的基質中，均勻攪拌30 min后，設定滴灌、料液、冷卻液溫度，當達到預設溫度時，將料液倒入的滴丸機加料裝置中，調節滴距，滴入冷卻劑二甲基硅油中，滴丸成型后取出瀝干，用干濾紙吸去表面的二甲基硅油，室溫下自然干燥后即得。按上述基質比例同法制備空白滴丸。

2.3.1 硬脂酸在基質中含量的確定 硬脂酸為常用的緩釋基質，可顯著延緩藥物在胃內的釋放。經預試驗，固定載藥量為25%，選取聚乙二醇6000為水溶性基質，考察硬脂酸用量占基質總量為10%、20%、30%時所制滴丸的圓整度、丸重差異及體外釋藥時間。參照“2.2.6”項中的方法并結合預實驗，考察所制備3批滴丸的體外釋藥時間。3批滴丸在釋藥5 h后每隔1 h取一次樣，配制溶液測定吸收度，并計算累積釋放度，統計累積釋放度達到95%以上所需時間，作為體外完全釋藥時間。結果見表1。

表1 硬脂酸含量對緩釋滴丸質量的影響

由上表可知： 3批緩釋滴丸的圓整度比值均接近1，符合《中國藥典》要求；硬脂酸含有量達30%時所制滴丸重量差異有10粒超過15%，不符合藥典要求，20%以下丸重差異較好；硬脂酸含有量越大，體外釋藥時間越長，硬脂酸含有量為10%時所制滴丸的體外釋藥時間為7 h，釋藥過快，不能達到緩釋目的，而當硬脂酸為20%時所制滴丸在12 h時幾乎完全釋藥，符合要求。

為了進一步確定硬脂酸的量，選擇硬脂酸占基質總量為15%、20%、25%，其他條件相同，制備3批穿心蓮內酯緩釋滴丸，由試驗結果可知，3批緩釋滴丸圓整度和丸重差異均符合要求，當硬脂酸量為20%時釋藥時間為12 h，符合緩釋要求，15%和25%的比例釋藥時間分別為10 h和14 h，不符合要求。綜上所述，本試驗確定硬脂酸在基質中的量為20%。

2.3.2 藥物與基質比例范圍的選擇 根據“2.3.1”項試驗結果，固定硬脂酸占基質的量，選擇藥物與基質的比例為1∶2，1∶3，1∶4的處方比例，滴制條件同“2.3.1”項，制備3批不同比例的緩釋滴丸，以圓整度，重量差異以及體外釋藥時間作為評價指標，方法同“2.3.1”項，考察緩釋滴丸的質量。結果見表2。

表2 藥物與基質比例對緩釋滴丸質量的影響

由試驗結果可知3批滴丸的圓整度和重量差異均符合要求， 由此可知，釋藥時間隨著基質比例的增加而逐漸增大。藥物與基質比例為1∶3的條件下所制滴丸在12 h幾乎完全釋藥。為了能夠進一步確定藥物與基質的最佳比例，篩選出藥物與基質的比例范圍為1∶2.5，1∶3，1∶3.5。

2.3.3 滴速的確定 經預試驗可知，當滴速為25滴/min時所制的滴丸，丸形圓整度好，丸重差異小，當滴速過大時，滴丸丸重減少，易發生黏連；當滴速過小時，丸重增加，易產生拖尾，導致圓整度差，故選擇滴速為25滴/min。

2.3.4 料液溫度范圍的選擇 考察藥液溫度為80、85、90、95、100 ℃對緩釋滴丸成型性和丸重的影響。由試驗結果可知，當藥液溫度過高時，所制滴丸丸重減輕、出現黏連現象；隨著藥液溫度的降低，所制滴丸丸重也越大，丸重差異增加，出現拖尾現象現象且滴制比較困難，故確定料溫范圍為85、90、95 ℃。

2.3.5 冷凝溫度范圍的選擇 考察冷凝液溫度為4、6、8、10、12 ℃對緩釋滴丸成型性的影響。由試驗結果表明當冷凝溫度過低時，所制滴丸冷卻明顯加快，圓整度差，硬度大；隨著冷凝溫度的升高，所制滴丸硬度也越來越差。故選擇冷凝溫度范圍為6、8、10 ℃。

2.3.6 滴距范圍的選擇 考察滴距為10、11、12、13、14 cm對緩釋滴丸成型性的影響。由試驗結果可知，滴距越大，液滴越易被跌散而產生細粒或成扁平狀；當滴距過小時，液滴來不及收縮成形就進入冷卻液，導致滴丸圓整度差且易發生黏連現象。故本試驗選擇11、12、13 cm。

2.3.7 正交試驗設計 結合試驗，選擇藥物與基質的比例(A)，滴距(B)，冷凝溫度(C)，料液溫度(D)為制備滴丸的四個影響因素，每個因素取3個水平，利用正交試驗助手軟件選用L9(34)進行正交試驗，以圓整度，重量差異，載藥率為指標進行考察，結果見表3～5。

載藥率的計算：取穿心蓮內酯緩釋滴丸若干粒，搗碎，精密稱取一定量粉末，加入適量甲醇振搖，使其溶解，移入100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即作為供試品待測溶液。取空白緩釋滴丸若干粒搗碎，精密稱取一定量(根據供試品中藥物與基質的比例稱取)，照以上方法制備，所得溶液作為空白滴丸溶液，采用紫外光譜法測定含量，計算載藥率。

載藥率=(實際測定量/理論量)×100%。

表3 正交實驗因素水平

表4 處方與工藝的正交實驗及結果分析

表5 方差分析結果

通過直觀分析可知，A因素的極差最大，其中A因素水平3均值最大，故A因素中水平3最好；其次是B，C因素極差較大，對實驗的影響較大，同理可得B、C因素均是水平2最好，D因素的極差最小，對實驗影響最小，因此將此列作為誤差列進行方差分析[11-12]。由表5可知，A因素對緩釋滴丸的制備具有一定的影響(P<0.1)，其他三個因素對滴丸制備的影響較小。

綜上所述，四個因素對緩釋滴丸制備影響排序為A>C>B>D，即藥物與基質比例對緩釋滴丸質量的影響最大，其次為冷凝溫度，滴距，最后為料液溫度。最佳制備工藝為A3B2C2D2，即藥物∶基質(1∶3.5)，基質中硬脂酸含量為20%，冷凝溫度為8 ℃，滴距為12 cm，料液溫度為90 ℃，滴速為25滴/min。

2.4 驗證性試驗 在最佳制備工藝條件下，分別制備3批穿心蓮內酯緩釋滴丸，以圓整度，重量差異，載藥率為考察指標，進行重現性考察，結果見表6。

表6 3批緩釋滴丸測定結果

結果表明，3批最佳工藝下的所制備緩釋滴丸平均丸重差異、圓整度、載藥率的RSD均小于2%，說明重復性良好，故優化制備工藝穩定可行。

故本實驗所制備穿心蓮內酯緩釋滴丸的優化處方為藥物∶基質(1∶3.5)，基質中硬脂酸含有量為20%，平均載藥率為82.83%，平均丸重為0.054 g(約相當于穿心蓮內酯0.010 g)。

2.5 體外釋放度的考察 照“2.2.6”項下的方法對最佳制備工藝條件下的6批穿心蓮內酯緩釋滴丸進行12 h的體外釋放度試驗，每批選取10粒滴丸(約相當于0.10 g穿心蓮內酯)分別投入至6個轉籃中，同時制備空白滴丸10粒作為對照，計算各取樣點的累積釋放率，繪制釋放曲線。結果見圖4。結果表明本處方工藝重現性好，性質穩定，緩釋作用明顯。

圖4 6批樣品釋放度的誤差曲線

2.6 體外釋藥模型考察 對最佳處方和制備工藝穿心蓮內酯緩釋滴丸進行體外釋放曲線模型擬合的研究。采用零級模型、一級模型、Higuchi 模型對累積釋放度數據按模型公式進行擬合，結果見表7。

表7 緩釋滴丸釋藥曲線擬合方程

由相關系數R2可知，穿心蓮內酯緩釋 滴丸外釋放模型擬合接近程度依次為：一級模型>零級模型> Higuchi模型，因此優化后的處方和工藝所制備的緩釋滴丸在體外釋藥規律更符合一級模型。

3 討論

3.1 在選擇最大吸收波長時，發現基質在藥物的最大吸收波長處有一定的吸收，經過對紫外光譜圖吸收度對比分析，選擇空白基質溶液為對照，可排除基質對藥物含量測定的干擾。

3.2 對穿心蓮內酯進行釋放介質篩選時，應盡可能地與體內環境相似，首選以水作為溶出介質，但穿心蓮內酯為難溶于水的藥物，為了提高該藥物在水中溶解度，需要加入一定量的表面活性劑或增溶劑等添加劑[13]，為了更好地模擬體內過程，藥物在釋放介質中的溶解度應符合漏槽條件，經溶解度實驗及溶出度實驗可知藥物在0.9%十二烷基硫酸鈉的水溶液滿足該條件，故本實驗選用該溶劑為釋放介質。

3.3 緩釋滴丸的成型和質量受各種因素的影響，因此在用正交試驗法優選制備工藝時，難于用一個指標來衡量。本研究以重量差異、圓整度、載藥率為指標優選工藝條件，結果更合理可靠。通過對表4和表5進行分析可知，藥物與基質比例是影響滴丸成型和質量的最主要因素，對載藥率有較大的影響，且隨著藥物與基質的比例增加而增大，這可能是由于基質量的增加提高藥物的分散度，使藥物分子不易形成聚集體，或使微粒不易形成聚附體，更多得分散在基質中，這樣不僅有助于藥物的均勻分布，提高緩釋滴丸中藥物含量均一性，而且在熔融操作及滴制過程中時可顯著減少藥物的浪費，提高緩釋滴丸的載藥率。

3.4 本實驗所制穿心蓮內酯緩釋滴丸的優化處方為藥物與基質比例為1∶3.5，基質中硬脂酸含有量為20%，平均載藥率為82.83%，所制備滴丸平均丸重約為0.054 g(約相當于穿心蓮內酯為0.010 g)，參照市售穿心蓮內酯滴丸，建議每次服用劑量為1.0 g，約20丸。

3.5 本實驗設計的處方為處方緩釋設計是要求藥物在體內緩慢釋藥達12 h，通過體外釋放度試驗，發現所制緩釋滴丸在2 h釋藥接近20%，6 h釋藥約75%，制劑服用后有望達到既可使血藥濃度快速達到治療窗范圍又能持續維持一段時間的藥物濃度的目的。

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