絞股藍總苷分散片指紋圖譜及3個成分的定量分析

于學海， 禹玉洪， 宋海龍， 辛 艷， 李葆春， 孟亞雄， 馬小樂， 王化俊*

(1.甘肅農業大學，甘肅 蘭州730070；2.亞寶藥業集團股份有限公司，山西 運城 044602)

絞股藍中含有較豐富的絞股藍皂苷、糖類、黃酮類、無機元素等化學成分[1]。其中絞股藍皂苷活性最強，國內報道已分離的有絞股藍皂苷A、人參皂苷Rd、人參皂苷F2、丙二醇、蕓香苷等[2]。研究發現，絞股藍不僅可預防冠狀動脈痙攣、心率不齊[3]。還具有降血糖[4]、降血壓[5]，抗腫瘤[6]、抗衰老[7]等作用。

分散片具有分散狀態佳、崩解時間短、藥物溶出迅速、吸收快、生物利用度高、不良反應少、服用方便等特點。由于其獨特的性能，近年來分散片日益引起人們的關注[8]。絞股藍總苷分散片主要用于養心健脾，益氣和血，除痰化瘀，降血脂。本研究主要是建立10批絞股藍總苷分散片的指紋圖譜，并對絞股藍皂苷A、人參皂苷Rd、人參皂苷F2這3種特征成分進行定量研究，為絞股藍總苷分散片質量控制提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司，配有二元高壓梯度泵及chemstation色譜工作站)；AB265S 分析天平(梅特勒科技有限公司)；ELSD 2000ES檢測器(奧泰萬譜科技有限公司)；DK-98-Ⅱ型水浴鍋(北京靈諾科技有限公司)；KQ-5200 DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 人參皂苷Rd對照品(批號130420，純度為97.6%)，絞股藍皂苷A對照品(批號130401，純度為99.4%)，人參皂苷F2對照品(批號130412，純度為98.8%)，以上3種對照品均為實驗室自制；絞股藍總苷分散片(亞寶藥業集團股份有限公司提供，批號分別為120801、111201、120101、120102、120201、120901、130401、120512、121114、130608)；所用試劑除乙腈和異丙醇為色譜純外，甲酸、乙酸及乙醇為分析純；水為超純水。

2 方法與結果[9-12]

2.1 色譜條件 Phenomenex luna C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm )，流動相為甲酸-異丙醇-水(1∶8∶91)(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0～10 min，27%～29%B; 10～20 min，29%～35%B; 20～40 min，35%～36%B; 40～50 min，36%～38%B; 50～80 min，38%～47%B; 80～90 min，47%B)；ELSD檢測器；體積流量0.8 mL/min，進樣體積10 μL，柱溫25 ℃，理論板數不低于3 000。色譜圖見圖1、圖2。

圖1 對照品色譜圖

圖2 樣品色譜圖

2.2 對照品溶液的制備 精密稱量絞股藍皂苷A,人參皂苷Rd,人參皂苷F2適量,分別制成質量濃度為1.02、1.008、1.006 mg/mL的3種對照品貯備液，分別精密吸取貯備液適量，加甲醇稀釋成質量濃度分別為絞股藍皂苷A 0.51 mg/mL、人參皂苷Rd 0.252 mg/mL、人參皂苷F20.12072 mg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品約460 mg，精密稱定，至25 mL量瓶，加入約20 mL50%甲醇，超聲處理30 min，冷卻至室溫，用50%甲醇定容，搖勻，取續濾液，即得。

2.4 線性試驗 精密吸取混合對照品溶液4、6、8、10、12、14 μL，注入液相色譜儀，分別測得峰面積值，以進樣量(X)為橫坐標，峰面積的Ln值(Y)為縱坐標作圖。得回歸方程分別為Y絞股藍皂苷A=1.590 9X+5.601 6(r=0.999 4)，Y人參皂苷Rd=1.680 6X+5.798 4(r=0.999 5),Y人參皂苷F2=1.634 8X+5.749 2(r=0.999 7)。結果表明絞股藍皂苷A在2.04～7.14 μg，人參皂苷Rd在1.01～3.53 μg，人參皂苷F2在0.48～1.69 μg 范圍內與色譜峰峰面積呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 精密吸取“2.2”項下對照品溶液10 μL，依據“2.1”項下色譜條件，連續進樣6次。結果顯示絞股藍皂苷A、人參皂苷Rd及人參皂苷F2的保留時間的RSD分別為0.8%、1.3%及1.0%，峰面積的RSD分別為0.8%、0.9%及1.4%，3成分含有量的RSD分別為0.7%、0.6%及1.0%。

2.6 重復性試驗 取批號為120801樣品，按“2.3”項下方法制備，平行制備6份，依據“2.1”項下色譜條件，分別進樣測定，結果顯示絞股藍皂苷A、人參皂苷Rd及人參皂苷F2的保留時間的RSD分別為1.3%、0.9%及1.7%，峰面積的RSD分別為1.8%、0.9%及1.5%，3成分含有量的RSD分別為0.8%、1.4%及1.7%，表明該方法重復性較好。

2.7 穩定性試驗 取樣品(批號120801)，按“2.3”項下方法制備，依據“2.1”項下色譜條件，在0、2、4、6、8、12、16、20、24 h分別進樣測定，結果顯示絞股藍皂苷A、人參皂苷Rd及人參皂苷F2的含有量的RSD分別為1.1%、1.9%及1.2%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.8 加樣回收率試驗 取120801批樣品6份，每份約0.3 g，精密稱定，每2份為一組，3組分別加入絞股藍皂苷A貯備液4.8、4、3.2 mL，人參皂苷Rd貯備液2.4、2、1.6 mL、人參皂苷F2貯備液1.2、1、0.8 mL，按“2.3”項下方法制備，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，依據“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，結果見表1～3。

表1 絞股藍皂苷A加樣回收率試驗

表2 人參皂苷Rd加樣回收率試驗

表3 人參皂苷F2 加樣回收率試驗

2.9 指紋圖譜的建立及相似度分析

2.9.1 指紋圖譜的生成及共有峰的確定 吸取10個批次絞股藍總苷分散片供試品溶液各10 μL，依據“2.1”項下色譜條件，進行測定，運用《中藥指紋圖譜相似度評價系統2008版》相似度評價系統軟件(下稱“軟件”)，得到10批樣品HPLC-ELSD指紋圖譜疊加圖(見圖3)，并且均有穩定的20個特征峰。其中6號峰為絞股藍皂苷A，12號峰為人參皂苷Rd，18號峰為人參皂苷F2。

2.9.2 對照指紋圖譜的生成 據已建立好的色譜條件對10批樣品進行測定，將結果運用軟件進行分析，以S1為參照圖，經過多點校正，自動匹配，生成對照指紋圖譜(R)，結果見圖3。

圖3 10批絞股藍總苷分散片HPLC-ELSD指紋圖譜(S1～S10)及對照指紋圖譜(R)

2.9.3 相似度分析 運用軟件，采用夾角余弦法計算10批樣品與對照圖譜的整體相似性，結果見表4。

2.10 樣品測定 取10批絞股藍總苷分散片約460 mg，按照“2.2”項下方法配制供試品溶液，依據“2.1”項下色譜條件測定每種產品中絞股藍皂苷A、人參皂苷Rd、人參皂苷F2的量。結果見表5。

表4 10批樣品與對照圖譜相似度結果

表5 樣品測定結果

結果顯示，不同批次的絞股藍總苷分散片中單體皂苷含有量及總皂苷差異均不大，說明絞股藍總苷分散片生產工藝較穩定，技術較成熟，質量較穩定。

3 討論

3.1 檢測器與色譜條件的確定 對紫外和蒸發光兩種檢測器進行了考察，結果顯示紫外檢測信號較復雜，干擾較多，且人參皂苷F2、人參皂苷Rd幾乎沒有信號。相比之下，蒸發光檢測信號清晰，且色譜圖各特征峰分離度良好，峰型較好，故選用蒸發光檢測器。

分別對乙腈-乙酸-水、乙腈-甲酸-水、乙腈-異丙醇-水、乙腈-甲酸-異丙醇-水、乙腈-乙酸-異丙醇-水，柱溫20、25、30 ℃等色譜條件進行了考察。結果表明，在流動相為乙腈-甲酸-異丙醇-水，柱溫為25 ℃色譜條件下，無論峰形還是分離度都較好。

3.2 提取方法的選擇 考察了超聲提取與回流提取方式，以及水、甲醇、50%甲醇、乙醇及50%乙醇提取溶劑，還有不同提取時間。結果表明，50%甲醇作為提取溶劑，超聲處理30 min為最佳的提取方法。

3.3 小結 本研究建立了10批絞股藍總苷分散片的HPLC-ELSD指紋圖譜，進行了指紋圖譜分析，相似度均達到0.977以上，并測定了3種特征成分的量，3種成分相對較穩定，說明絞股藍總苷分散片在生產工藝方面均較穩定，制備工藝較接近。

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