RP-HPLC法測定腦力寶丸中5種成分

章運典， 周里欣， 薛素娟， 陳玉海

(河南省宛西制藥股份有限公司，河南 南陽 474500)

腦力寶丸由遠志、地黃、五味子、地骨皮、菟絲子、茯苓、石菖蒲、川芎、維生素E、維生素B1等十味藥材組成，遠志為其君藥，為遠志科植物遠志或卵葉遠志的干燥根。春、秋二季采挖，除去須根和泥沙，曬干[1]，具有滋補肝腎，養心安神之功效，臨床上多用于治療肝腎不足，心神失養等引起的健忘失眠等神經系統疾病[2-3]。遠志中皂苷類成分居多，但因其分類多且不夠穩定，故《中國藥典》2010年版收載了遠志口山酮Ⅲ和3,6′二芥子酰基蔗糖為遠志的指標性成分。此方中五味子為臣藥，其含有豐富的木脂素類，且性質穩定[4-5]。腦力寶丸原采用部頒標準[6]的薄層色譜法，隨著現代檢測技術的快速提高以及高效液相色譜技術的普及，原薄層色譜法因其操作復雜，重復性差，準確度低等原因已滿足不了檢測要求，故在此選用遠志口山酮Ⅲ、3,6′二芥子酰基蔗糖、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素為檢測指標，建立了反相高效液相色譜法[7-12]，以此來提高檢測數據的準確性，也可作為腦力寶丸內部控制的方法依據。

1 材料和儀器設備

1.1 試藥 仲景牌腦力寶丸(批號120701、120702、120801)；遠志口山酮Ⅲ對照品(批號111850-201203)、3,6′二芥子酰基蔗糖對照品(批號111848-201202)、五味子醇甲對照品(批號110857-200709)、五味子甲素對照品(批號110764-201010)、五味子乙素對照品(批號110765-200710)均購自中國藥品生物制品檢定所；HPLC用水為超純水，甲醇、乙醇、冰醋酸為色譜純，其他試劑為分析純，均經0.45μm微孔濾膜濾過后使用。

1.2 儀器設備 Agilent 1100色譜儀；VWD檢測器；中興DZKW-4電子恒溫水浴鍋；UP超純水機；HANGPING FA2104V電子天平；KQ-300DE型數控超聲波清洗器。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

2.1.1 遠志 Agilent 1100色譜儀；Agilent HC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈-0.05%磷酸(18∶82)為流動相；體積流量1.0 mL/min；檢測波長320 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

2.1.2 五味子 Agilent 1100色譜儀；Agilent HC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以甲醇-水(75∶25)為流動相；體積流量1.0 mL/min；檢測波長254 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.2 樣品制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取遠志口山酮Ⅲ和3，6′二芥子酰基蔗糖對照品適量，加甲醇制成每1 mL含遠志口山酮Ⅲ0.012 5 mg、3，6′二芥子酰基蔗糖0.0436 mg的混合對照品貯備液；另精密稱取五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素對照品適量，加甲醇制成每1 mL含五味子醇甲0.174 mg、五味子甲素0.032 mg、五味子乙素0.056 mg的混合對照品貯備液。

2.2.2 遠志中成分測定用供試品溶液制備 取本品30丸，除去糖衣，研細，取約1 g，精密稱定，加70%甲醇20 mL，稱定質量，加熱回流1.5 h，放冷，濾過，濾液置25 mL量瓶中，用少量70%甲醇分數次洗滌容器及濾器，洗液濾入同一量瓶中，加入70%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 五味子中成分測定用供試品溶液制備 取本品30丸，除去糖衣，研細，取約1 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加正己烷40 mL，密塞，稱定質量，超聲處理(頻率45 kHz，功率300 W)30 min，放冷，再稱定質量，加正己烷至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液10 mL，揮干，殘渣加甲醇溶解，置5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.4 陰性供試品溶液制備 按處方比例分別制備不含遠志和五味子的樣品，按“2.2.2”項和“2.2.3”項下供試品溶液的制備方法，制備陰性供試品溶液。

2.3 系統適用性試驗 分別吸取兩種對照品溶液,供試品溶液和陰性供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀進行分析，結果表明陰性供試品溶液在與對照品峰相同的保留時間處無干擾峰出現，說明處方中其他藥味對測定結果無影響。

2.4 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項下遠志混合對照品貯備液1、5、10、15、20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，再精密吸取“2.2.1”項下五味子3種成分混合對照品貯備液2、4、6、8、10、12 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積積分值為縱坐標(Y)，進樣量(X，μg)為橫坐標進行回歸計算，得回歸方程分別為遠志口山酮ⅢY=1 269.6X+2.242 3(r=0.999 4)，3，6′二芥子酰基蔗糖Y=1 662.5X+11.591(r=0.999)，五味子醇甲Y=426.86X-8.167 2(r=0.999 4)，五味子甲素Y=847.99X+8.733 3(r=0.999 4)，五味子乙素Y=664.24X-4.08(r=0.999 3)，結果表明遠志口山酮Ⅲ在0.012 5～0.250 μg，3,6′二芥子酰基蔗糖在0.043 6～0.872 μg，五味子醇甲在0.348～2.088 μg，五味子甲素在0.064～0.384 μg，五味子乙素在0.112～0.672 μg范圍內，其對照品質量與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下兩種對照品液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，按峰面積計算RSD值。遠志口山酮Ⅲ、3,6′二芥子酰基蔗糖、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的RSD分別為0.97%、0.86%、0.69%、0.71%和0.95%，結果表明，儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗 取“2.2.2”項和“2.2.3”項下兩種供試品溶液，室溫放置，按“2.1”項下色譜條件分別在0、2、4、6、8、10 h進樣測定，記錄色譜峰面積，結果遠志口山酮Ⅲ、3，6′二芥子酰基蔗糖、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素峰面積RSD分別為1.26%、1.07%、1.33%、1.25%和0.98%，表明供試品在10 h內穩定。

2.7 重復性試驗 精密稱取同一批樣品(批號120701)，按“2.2.2”項和“2.2.3”項下方法分別平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算得遠志口山酮Ⅲ、3,6′二芥子酰基蔗糖、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的RSD值分別為1.13%、0.81%、1.24%、1.57%和1.16%，表明該方法重復性好。

2.8 回收率試驗 稱取已知含有量(遠志口山酮Ⅲ0.44 mg/g、3,6′二芥子酰基蔗糖1.31 mg/g)的樣品(批號120701)約0.5 g，精密稱定，精密加入0.107 mg/mL遠志口山酮Ⅲ對照品溶液2 mL，0.326 mg/mL 3,6′二芥子酰基蔗糖對照品溶液2 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。再稱取已知含有量(五味子醇甲3.05 mg/g、五味子甲素0.62 mg/g、五味子乙素1.42 mg/g)的樣品(批號120701)約0.5 g，精密稱定，精密加入0.83 mg/mL五味子醇甲對照液2 mL、0.311 mg/mL五味子甲素對照品溶液1 mL、0.712 mg/mL五味子乙素對照品溶液1 mL，按“2.2.3”項下的方法制備供試品溶液。按“2.1”項下方法進行測定，計算回收率。結果遠志口山酮Ⅲ、3,6′二芥子酰基蔗糖、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的平均回收率分別為98.44%、98.21%、99.26%、98.82%、98.81%，RSD分別為1.30%、0.78%、0.54%、0.89%、1.01%，見表1。

表1 加樣回收率試驗結果(n=6)

2.9 樣品測定 取3批樣品(批號120701、120702、120801)，每批3份，按“2.2.2”項和“2.2.3”項下方法分別制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件對3批樣品進行測定，記錄峰面積，外標法計算，數據以平均數標準差表示，測得結果如下表2。

表2 樣品測定結果

3 討論

遠志為腦力寶中的主藥，其有效成分為皂苷，遠志口山酮，寡糖酯和生物堿等。原部頒標準中其薄層色譜法采用遠志皂苷元水解液而不是總皂苷作為其中成分定量測定方法也證實了其不穩定性，在分離遠志的實驗中多次發現已經提純的皂苷又變成多個成分的混合物。故本實驗選擇遠志口山酮Ⅲ和3,6′二芥子酰基蔗糖作為遠志在腦力寶丸中的質量控制指標。五味子中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素在254 nm處均有最大吸收，且用同一流動相檢測，均能達到良好效果。故本實驗對這3種成分同時測定，操作簡便又節約資源。

腦力寶丸中遠志皂苷元定量檢測采用的是衛生部藥品標準中藥成方制劑第十四冊薄層掃描法，該方法在操作中的點樣、展開分離、顯色操作等步驟人為因素影響很大，且受環境溫濕度影響，達不到良好的檢測效果，依據《中國藥典》2010年版一部采用HPLC法并增加了五味子中3種成分定量測定，提升了標準，避免了環境、人員影響，且操作簡便，專屬性強，準確度高，故該方法可作為該品種內部控制的定量檢測方法。

參考文獻：

[1] 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典：2010年版一部[S]．北京:中國醫藥科技出版社，2010:32.

[2] 李典國，吳攀創，巫利婉．腦力寶治療神經衰弱112例臨床療效觀察[J]．廣東醫學，1997，18(2): 149.

[3] 張永祥，孟紫芝，鄭詩峰．腦力寶臨床療效分析[J]．實用醫學雜志，1985，6:14-24.

[4] 應國清，俞志明，單劍鋒．北五味子有效成分研究進展[J]．河南中醫，2005，25(6):84-87.

[5] 逄世峰，鄭培和，許世泉．炮制對五味子木脂素類成分的影響[J]．中成藥，2011，33(2):284-286.

[6] WS3-B-2769-97．衛生部藥品標準中藥成方制劑第十四冊[S].

[7] 劉艷芳，楊曉娟，田 昕．HPLC法測定遠志中2種活性成分的含量[J]．藥物分析雜志，2010，30(5):806-809.

[8] 巴寅穎，解素花，呂 航，等．基于抗癡呆類藥成分西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6和遠志口山酮Ⅲ的開心散質量控制方法研究[J]．北京中醫藥大學學報，2010，35(4):273-277.

[9] 吳曉鳳，陳 虹，趙志茹. HPLC法測定生脈飲中五味子醇甲的含量[J]. 中國中藥雜志，2003，28(1):43-44,76.

[10] 耿立超，楊中林. HPLC法測定不同產地五味子中木脂素含量[J]. 中醫藥學報，2007，35(2):47-48.

[11] 丁 佐，魯巍巍，李宏博. HPLC法同時測定北五味子中五種木脂素的含量[J]. 中國中藥雜志，2010,35(13):1728-1730.

[12] 秦鳳蓮.HPLC法測定五味子炮制品中3種木脂素類成分的含量[J]. 臨床和實驗醫學雜志，2009,8(2):39-40.