川芎嗪改善哮喘大鼠氣道高反應性的作用觀察

王雅娟， 朱慧志， 孔獻春， 鹿 林， 劉 璐， 張 玉， 李澤庚*

(1.安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230038； 2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院，安徽 合肥 230038)

支氣管哮喘(bronchial asthma,簡稱哮喘)是常見的慢性呼吸道疾病之一, 近年來其患病率在全球范圍內有逐年增加的趨勢，嚴重威脅著人類的健康[1]。支氣管哮喘屬祖國醫學“哮病”、“呷嗽”等范疇，病因為外邪侵襲、痰濁阻肺、肺腎虧虛所致。多部古書中均指出瘀亦與痰在哮病病理過程中并存。痰可致瘀，痰也可因瘀而生。哮病夙根當為痰、瘀、虛三者。臨床治療包括從脾、肺、腎、肝論治或從痰飲、瘀血論治[2-3]。

傘形科植物川芎是歷史悠久的活血化瘀中藥，味辛性溫，功能為活血化瘀、行氣開郁、祛風止痛。《本草綱目》謂其為“血中氣藥”。川芎嗪(ligustrazine, LTZ)是由川芎中提取的2，3，5，6-四甲基吡嗪，簡稱四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine,TMP)。中藥川芎在治療哮喘的臨床應用上已有20多年，已證實其對哮喘有輔助治療作用，而川芎嗪也常常用做臨床上治療哮喘的輔助用藥[4-6]。已有研究證實川芎嗪對哮喘動物模型具有一定的治療作用并能夠調節p38蛋白激酶、抑制血管平滑肌細胞鈣離子內流、降低血清和支氣管肺泡灌洗液中的TNF-a水平，具有糖皮質激素樣抗炎作用及抗氣道重塑的作用[7-9]。但關于川芎嗪對哮喘大鼠的肺功能及氣道高反應性的改善作用至今未見報道。本實驗通過觀察川芎嗪對哮喘大鼠的肺功能及氣道高反應性的影響，以及對相關細胞因子水平的影響，以驗證川芎嗪對支氣管哮喘的治療效果，并初步探討其機制，為進一步有效防治哮喘病，開發川芎嗪的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑 卵白蛋白(Ovalbumin，OVA，V級，美國Sigma產品)；氨甲酰膽堿(Methacholine, Mch, Sigma公司，批號79H1505)；注射用鹽酸川芎嗪(哈爾濱三聯藥業有限公司，批號111103A2)；地塞米松磷酸鈉注射液(蕪湖康奇制藥有限公司，批號120211)，其余均為國產分析純。

1.2 實驗動物 Sprague-Dawley大鼠，清潔級，雄性，體質量160～180 g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，動物合格證號：Scxk(滬)2008-0016。

1.3 實驗儀器 霧化吸入器(980型，上海新天緣醫療設備有限公司)；動物肺功能儀(V5.0，南京美易公司)；磁力攪拌器(JB-4，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；顯微鏡(Olympus BX51, Germany)；TGL-18R冷凍離心機(黑馬儀器公司)；低速離心機(上海飛鴿離心機TDL-40B)；可調式移液器(Eppendorf可調式移液器)；低速離心機(型號SC-3610 科大創新股份有限公司中佳分公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 哮喘模型的制備與實驗給藥 大鼠分為正常對照組、哮喘模型組、川芎嗪高劑量組、川芎嗪低劑量組、地塞米松組，每組15只。哮喘模型采用以0.2%的OVA(Grade V)凝膠十點致敏，并以1%的OVA生理鹽水溶液霧化攻擊復制，用新鮮配制的10%氫氧化鋁凝膠溶入OVA，OVA的終質量分數為0.2%，對哮喘模型組和給藥組動物進行十點致敏法，包括兩前后足跖4點，兩腹股溝2點，頸部1點，背部左、中、右3點，每點皮下注射0.05 mL 0.2%卵白蛋白凝膠，腹腔注射0.5 mL，共計1 mL/鼠[10]。致敏第14天開始用1%的OVA霧化(德國Master超聲霧化器，1～5 m partica1)吸入30 min進行攻擊，持續7 d，同時每次攻擊前0.5 h腹腔注射給予各治療藥物，每天一次，持續7 d：川芎嗪高劑量組給予川芎嗪注射液80 mg/(kg·d)，川芎嗪低劑量組給予川芎嗪注射液40 mg/(kg·d)，地塞米松組給予地塞米松注射液0.1 mg/(kg·d)[11]。

1.4.2 大鼠Mch的氣道反應性的測定 致敏大鼠末次攻擊24 h后將大鼠用6%水合氯醛6 mL/kg腹腔注射麻醉，行氣管插管后，置于密閉的自制身體容積描記器內。用動物肺功能儀記錄麻醉大鼠霧化吸入Mch前后的氣道阻力(RL)和肺順應性(Cdyn)。實驗時吸入的Mch由超聲霧化器霧化，吸入質量濃度依次為0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 g/L，每一質量濃度霧化吸入20 s，間隔5～10 min后吸入下一個質量濃度，觀察并記錄吸入后5 min內RL和Cdyn的變化。

1.4.3 大鼠血清IgE水平的測定 大鼠股動脈取血，離心分離血清，ELISA試劑盒檢測血清IgE水平。

1.4.4 大鼠肺組織HE染色 大鼠股動脈放血處死，取肺組織，于10%甲醛固定，常規石蠟包埋，待做HE染色觀察肺組織病理學變化。

2 結果

2.1 川芎嗪對哮喘大鼠肺功能及氣道高反應性的影響 肺通氣的阻力是肺通氣過程中所遇到的阻力，分為彈性阻力和非彈性阻力。彈性阻力包括肺的彈性阻力和胸廓的彈性阻力，非彈性阻力包括氣道阻力、慣性阻力和組織的黏滯阻力。本實驗主要用動物肺功能儀記錄麻醉大鼠霧化吸入Mch前后的RL和Cdyn的變化。根據實驗所得數據，分別繪制肺順應性變化柱狀圖(圖1A)和肺阻力變化柱狀圖(圖1B)。結果發現，模型組大鼠肺順應性明顯低于正常組大鼠而肺阻力明顯高于正常組大鼠(P<0.05)，且隨著Mch刺激質量濃度的增加，肺順應性逐漸下降，而肺阻力逐漸上升，且模型組大鼠肺功能柱狀圖變化趨勢大于其他各組，說明模型組大鼠對Mch的敏感性高于其余各組(圖1)。川芎嗪高、低劑量組均能夠明顯改善氨甲酰膽堿誘導的哮喘大鼠的氣道高反應性(P<0.05)，越高質量濃度的氨甲酰膽堿刺激改善作用越明顯，其中對肺順應性下降的改善作用優于對肺阻力增加的改善作用，川芎嗪高、低劑量組之間沒有明顯差異。

圖1 川芎嗪對哮喘模型大鼠甲酰膽堿刺激的氣道高反應性的影響

2.2 川芎嗪對哮喘大鼠血清IgE水平的影響 支氣管哮喘是一種氣道慢性炎癥性疾病，因此IgE在支氣管哮喘發病中起著關鍵作用，哮喘患者的IgE水平較正常人明顯升高，IgE的水平和炎癥、免疫等多種因素相關，本實驗研究發現，哮喘模型組大鼠的血清IgE水平較正常對照組明顯升高(P<0.01)，川芎嗪高、低劑量組均能夠一定程度的降低哮喘大鼠的IgE水平，提示其對哮喘的發生發展可能起到抑制作用，見圖2。

圖2 川芎嗪對血清IgE水平的影響

2.3 川芎嗪對肺組織炎癥細胞浸潤的影響 肺組織經HE染色觀察病理改變，由圖3可見，正常對照組氣道壁及肺泡結構正常，氣管黏膜上皮完整，未見炎癥細胞浸潤，OVA致敏模型組可見氣道周圍及肺間質有大量炎癥細胞浸潤(以EOS、淋巴細胞為主)，支氣管管壁增厚、管腔狹窄，支氣管管壁及平滑肌較對照組增厚。川芎嗪高、低劑量組和模型組相比炎癥細胞浸潤明顯減少，支氣管管壁及平滑肌較模型組變薄，其中川芎嗪高劑量組和地塞米松組效果相當(圖3)。

圖3 HE染色觀察川芎嗪對肺組織炎癥細胞浸潤的影響

3 討論

據流行病學調查研究，全球約有3億患者，各國患病率不等。我國哮喘患病率呈逐年上升趨勢，且兒童患病率高于青壯年，老年人群的患病率有增高的趨勢[1]。目前認為哮喘的發病機制涉及多種細胞(如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞等)以及細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。這種慢性炎癥與氣道高反應性相關，通常出現廣泛多變的可逆性氣流受限，并引起反復發作性的喘息、氣急、胸悶或咳嗽等癥狀[12]。目前對哮喘的發作治療主要以糖皮質激素聯合b2受體激動劑為主，但這些藥物并不能從根本上抑制哮喘的氣道炎癥、防止哮喘的發作且長期應用副作用大，因此有必要尋找對哮喘的慢性炎癥及急性發作有防治作用的新藥。

川芎嗪在臨床上可用于哮喘的輔助治療，有鹽酸鹽和磷酸鹽兩種制劑，藥理研究證實其具有抗血小板聚集，使已聚集的血小板有解聚作用，擴張血管，增加心腦血流量，改善微循環，是良好的活血行氣、祛風止痛之藥物[13]。可通過增加支氣管平滑肌內cAMP水平、抑制炎癥因子釋放、調節Th1/Th2平衡等途徑對支氣管平滑肌產生松弛作用，從而對支氣管哮喘起到一定的治療效果，而哮喘的急性發作根源為氣道的高反應性，目前對于川芎嗪對哮喘模型的氣道高反應性的研究鮮見。

有研究結果表明，通過對大鼠氣道插管機械通氣測定肺氣道阻力和順應性是測定哮喘大鼠氣道反應性的常用指標，它能夠較好地、直接地反映氣道阻力的變化。對大鼠行氣道反應性測定有助于進一步研究哮喘的發生機制及免疫和病理生理機制具有重要意義[14]。本實驗中對照組的肺順應性和肺阻力呈相反狀態變化，說明在自然狀態下，隨著接觸外部環境的時間增多，肺部阻力是在增大的，肺的通氣功能是呈現下降的趨勢。本實驗中模型組大鼠隨著氨甲酰膽堿刺激濃度的不斷加大，肺阻力逐漸增大，順應性逐漸降低，且呈現明顯的劑量依賴性。川芎嗪高、低劑量組大鼠的氣道高反應性和模型組相比均有所改善，隨著氨甲酰膽堿刺激質量濃度的增加，其所誘發各給藥組哮喘大鼠的肺阻力的增加及非順應性的下降趨勢明顯弱于模型組，尤其是對于氨甲酰膽堿誘導的肺阻力的增加抑制作用明顯，且越高質量濃度的氨甲酰膽堿刺激，藥物對氣道高反應性的抑制作用越明顯。說明川芎嗪可明顯抑制哮喘急性發作時的氣道高反應性，長期給予川芎嗪治療可能起到預防哮喘急性發作或減輕發作程度、降低致死率的作用。免疫球蛋白IgE，是介導I型超敏反應的主要物質。其數值的增高，與機體免疫系統有關。哮喘發生時IgE水平增高，可引起免疫細胞釋放炎癥介質，導致平滑肌收縮、黏液分泌增加、血管通透性增高和炎性細胞浸潤，促成哮喘的急性發作[15]。我們的實驗發現川芎嗪可降低哮喘大鼠血清IgE水平，但各組間數值絕對值變化不明顯，可能與IgE水平的影響因素眾多有關。肺組織HE染色結果表明川芎嗪能夠抑制哮喘大鼠肺組織嗜酸性粒細胞、中性粒細胞等炎癥細胞的浸潤，說明其可能對哮喘的急性發作和炎癥發展有一定的防治作用。

已有的研究[16]表明川芎嗪可降低哮喘大鼠肺組織GATA-3和IL-5的表達，減少嗜酸性粒細胞在肺組織的浸潤，有效抑制哮喘的氣道炎癥。氣道炎癥性反應降低，使氣道管徑增大，病變減輕，哮喘的癥狀得以緩解。本實驗發現川芎嗪對于哮喘大鼠模型中氨甲酰膽堿誘導的氣道高反應性有明顯的抑制作用，能夠改善大鼠肺功能，抑制血清IgE水平并抑制肺組織及氣道炎癥，可能對哮喘的急性發作起到預防作用，并改善哮喘發展過程中的慢性炎癥。但是川芎嗪為何會具有這些作用，這些作用發生的前提是什么？川芎嗪對哮喘大鼠氣道高反應性的抑制作用究竟來源于其抗炎作用還是松弛平滑肌或是二者兼有？其深層機制又是什么？是通過受體起效還是影響生化酶類？這些問題還有待于進一步探討。

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