細菌生物膜形成及相關耐藥性治療研究進展

溫紹霞，孫 競

(1.十堰市西苑醫院檢驗科，湖北 十堰 442000；

2.湖北醫藥學院附屬太和醫院檢驗科，湖北 十堰 442000)

細菌生物膜形成及相關耐藥性治療研究進展

溫紹霞1，孫 競2

(1.十堰市西苑醫院檢驗科，湖北 十堰 442000；

2.湖北醫藥學院附屬太和醫院檢驗科，湖北 十堰 442000)

生物膜是細菌在其生長過程中為了適應周圍環境而形成的一種保護性生存狀態。細菌以生物膜形式存在時其耐藥性明顯增加。近些年來，廣譜抗生素的廣泛使用伴隨著細菌生物膜的形成，給臨床治療帶來嚴峻的挑戰。本文就當前生物膜形成過程、調控機制及相關治療措施等方面的研究進展作一綜述。

細菌生物膜；耐藥性；形成過程；調控機制；治療措施

感染性疾病與傳染性疾病是目前導致人類死亡的重要病因。在細菌感染過程中，與其致病力密切相關的主要包括各種毒力因子。近年來的研究發現除此之外，生物膜的形成也是很多細菌致病性與產生耐藥性的原因之一。對于肺炎克雷伯菌，很多臨床分離株在體外和體內都能夠形成生物膜，肺炎克雷伯菌臨床分離株的耐藥性與細菌在聚苯乙烯及呼吸道上皮細胞上的粘附力相關。

細菌生物膜是細菌在生長過程中為適應生存環境而粘附于物體或活性組織表面，并包被于其自身產生的細胞外多糖基質中形成的一種與浮游細菌生長方式完全不同的細菌微生物群落，是細菌的特殊存在形式。許多細菌形成生物膜形成后所表達的基因產物與浮游細菌不同，細菌的生理狀態以及形態[1]也不相同，這使它的適應能力比浮游細菌更強。生物膜是細菌適應環境而采取的一種生存策略，是抵抗機體防御和限制抗菌藥物接近細菌的天然屏障。生物膜的形成一方面促進細菌逃避機體免疫系統的作用[2]，阻礙細胞吞噬或減少吞噬作用與氧活性降低后的應激反應；另一方面可以阻止或延緩藥物的滲透，生物膜內細菌的生理學特點影響了細菌對藥物的敏感性[3]。

由于某些致病菌主要是在人體內外和醫療材料表面形成細菌生物膜，抗生素可以殺滅浮游細菌，而處于細菌生物膜深處的細菌卻難以被清除，這也是慢性感染性疾病發作反復和難以控制的原因之一。例如在肺炎克雷伯菌致病過程中，由于生物膜的形成致使感染經常呈現靜止期與急性發作期交替、易復發、難根治等特點。細菌生物膜的形成已成為全球關注的熱點問題，本文將就生物膜形成過程，調控機制及相關治療措施等方面的研究進展綜述。

1 細菌生物膜的形成過程及調控機制

生物膜是細菌、真菌、原蟲被它裹在其自身分泌的多聚物種所形成的一種特殊的細菌群落，具有高度的組織性與系統性。生物膜的形成是多因子共同作用的結果。無論微生物表型的結構如何，以及涉及的細菌種類如何復雜，生物膜的形成是一個動態的高度依賴于環境信號的過程，整個過程包括開始、成熟、維護和分解四個階段[4]。在生物膜形成過程中，細菌首先粘附于固體的表面，這樣才能夠形成成熟的生物膜，因此細菌生物膜從游離的單個細胞到形成成熟的生物膜的重要階段是開始吸附到附著物表面。隨著微菌落的不斷形成以及細菌的粘附并定植在宿主皮膚、黏膜上皮細胞，然后侵入組織細胞生長繁殖，分泌水、胞外多糖、蛋白質等物質，將其本身包裹其中，生物膜不斷增厚，發展成熟。雖然生物膜一般處于靜止狀態，但是它仍屬于一個動態過程，生物膜聚集和成熟之后，其中有一小部分細胞可能會離開成熟的生物膜，并將其擴散傳播到遠處，因此，在生物膜傳播相關感染中細菌生物膜的分離釋放具有重要的作用[5]。胡金樹等[6]認為細菌從細菌生物膜脫離，主要依靠外界的作用力，或者自我分離播散到其他環境，從而引起感染。

生物膜的形成是高度依賴于基因調控集網絡浮游生物之間的轉換。這些網絡集成環境通過適當的傳感系統觸發的信號適當的反應，包括雙組分信號轉導通路與密度感應系統等(QS系統)。雙組分系統(TCS)和EC信號轉導通路的主要信號是由細菌監測外部和內部的刺激（例如營養素、離子、溫度、氧化還原狀態），并把這些信號轉換成自適應反應。QS系統也稱為密度感應系統，是細菌感受菌體密度的一種環境感應系統。密度感應系統對生物膜的形成及維持具有重大意義，它可以使生物膜中的營養物質、酶、代謝產物和廢物正常的運輸和排出，而且整個細菌群體行為也需要通過密度感應系統來控制并協調，共同對周圍環境刺激做出反應，整個細菌群體的生存能力得到極大的提高。QS系統通過自分泌的小分子信號調節生物膜形成[7-8]。AHL是已被證實的革蘭氏陰性菌群體感應系統最常見的生物膜細胞間信息傳遞分子，在形成和維持細菌生物膜的三維結構中，AHL起著關鍵作用。高絲氨酸內酯環是這類化合物的共同特征，不同細菌都含有相同的高絲氨酸內酯環，而酰基側鏈中的碳鏈長度(從4到18個)和第三位上的基因(氫，羥基，羧基)決定該類信號分子對細菌的不同調控作用[9]。當多個細菌集中在一個部位時，由于環境濃集，AHL的濃度會升高，達到一定閾值時，可以與細胞內的蛋白受體結合并激活受體，調節細菌體的某些功能基因的表達，導致細菌分泌出構成胞外基質的糖蛋白復合物，形成細菌生物膜完整的結構。在大多數革蘭氏陽性細菌中，群體感應系統(QS)的信號分子是產生修飾后寡肽，信號識別系統的組成是雙組分磷酸激酶，當信號識別分子膜上激酶識別后，引起氨基酸殘基磷酸化，由天冬氨酸殘基傳遞，磷酸基因被傳遞給受體蛋白，于是此受體蛋白與DNA特定靶點結合，調控QS系統。革蘭氏陽性菌的群體感應系統可對多種細菌行為進行調控，如枯草芽胞桿菌的產芽胞、肺炎球菌中致病基因的表達。

2 細菌生物膜感染的耐藥性

由于生物膜細菌與浮游細菌不同，其耐藥性也不一樣，生物膜內細菌對抗菌藥物敏感性低于游離狀態。

周潔等[10]認為細菌耐藥機制有以下一種或幾種原因：(1)抗生素對生物膜滲透限制性：各種分子在生物膜的類型包括EPS和DNA構成了一個抗菌屏障。研究表明喹諾酮類藥物可以很快進入到銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌生物膜的深部[11-12]，反復、長期使用利于細菌啟動內酰胺酶的表達，使耐藥發生突變，水解內酰胺酶類抗生素。(2)生物膜中微生物的異質性：生物膜內化學微環境存在差異，生物膜內由表及里的氧氣濃度、pH值、營養物質及滲透壓存在梯度變化，決定了其內細菌對抗生素表現出不同的敏感性[13]，使生物膜表現出耐藥性。(3)生物膜生長模式的生理變化性：Adams等[14]發現有rpos表達陽性的E.coli生物膜有大量的高密度活性細菌，這可能是由于細菌在缺乏營養或聚集較多的有毒代謝物質等條件下生長緩慢，rpos基因被激活。細菌生物膜中有一部分細菌分化為類芽胞生長狀態，這類亞群細菌具有廣譜的耐藥性。此外，近年來研究表明，生物膜內細菌可通過主動外排機制及細菌間的感應系統，調節抗生素與細菌體內的作用位點，從而在生物膜抗藥機制中有一定的作用。生物膜通過減少細胞因子的產生、誘導補體轉化等方式對抗機體免疫防御。王云英等[15]曾報道肺炎克雷伯菌細菌生物膜抑制THP-ITLR2蛋白水平的表達，TLR2激活抗原呈遞細胞能力降低，減少細胞因子(TL-8和TL-12)和化學激活因子的產生，使機體免疫功能下降。

綜上所述，細菌生物膜耐藥性的產生可能是多方面因素共同作用的結果，主要依據不同發展階段的生物膜，菌種(株)的不同及抗生素的類型而定。

3 細菌生物膜相關感染的防治

3.1 抗菌生物材料 細菌生物膜的形成大多與生物醫學材料有關，在生物膜材料中加入抗菌藥物可抑制表面生物膜的形成，用鑄膜的方法在形成硅膠的前提下加入利福平，可明顯抑制硅膠表面表皮葡萄球菌粘附和生長[16]。選用低表面能材料（如特氟龍、高彈力硅膠或聚烏拉坦等）可使生物膜相關的感染發生率降低。聚乙二醇是親水聚合物排斥體積及反滲透壓均很大，可以產生強的抗細菌粘附能力，常被用來做表面改良劑[17-18]。經聚乙二醇涂附的生物材料對大多數革蘭氏陰性菌有很好的抗菌作用。

3.2 抑制細菌QS系統 不同的細菌在不同群體感應系統，如葡萄球菌有Agr群體感應系統。銅綠假單胞菌有lasR和rhlR群體感應系統，N-酰基高絲氨酸內脂作為群體感應信號，除了參與生物膜的合成外，還與細菌素性因子的產生、抗生素的合成或降解、質粒結合轉移等多種生物功能有關，并且可以誘導宿主細胞的凋亡[19]，是導致細菌持續或反復感染的重要分子。實驗發現氨溴索下調銅綠假單胞菌群體感應系統信號分子N-酰基高絲氨酸內酯以及N-酰基高絲氨酸內酯合成酶編碼的基因的表達，并且能增強抗生素對細菌生物膜的滲透作用[20]，還能破壞成熟的細菌生物膜結構[21]。因此，抑制細菌的群體感應信號，將成為控制感染合成新型抗菌藥物的重要方法。

3.3 抗生素藥物 氟喹諾酮類藥物與大環內酯類藥物聯合使用可以有效抑制細菌合成多糖蛋白復合物，從而抑制生物膜的形成。對于慢性感染中的生物膜，Wallwork等[22]研究發現大環內酯類抗生素對治療鼻竇炎有效。但是由于生物膜具有獨特的耐藥性，埋藏的細菌能抵抗抗生素，在體內繼續存在，導致感染再次發作，造成患者病情反復，難以治愈。

3.4 中草藥 中草藥可抑制細菌生物膜的形成，與抗生素聯合應用可增強抗生素的抗感染能力，并且中藥價格低廉，來源廣泛，毒副作用小，不容易導致細菌耐藥，在菌體內作用廣，藥理效應多，在防治細菌生物膜引起的感染方面具有獨特的優勢。孔晉亮等[23]研究了黃芩水煎液聯合左氧氟沙星或頭孢他啶對銅綠假單胞菌生物膜的作用，結果顯示黃芩水煎液可抑制，破壞銅綠假單胞菌生物膜，并且與左氧氟沙星或頭胞他啶聯用后生物膜內活菌數量減少，表明黃芩水煎液本身破壞細菌生物膜，同時對左氧氟沙星和頭孢他啶有增效作用。本課題組經實驗發現終濃度為30μg/ml黃芩素可減慢肺炎克雷伯菌生長速度，減少肺炎克雷伯菌對載體的吸附，抑制和清除肺炎克雷伯菌細菌生物膜。

3.5 超聲 實驗研究表明，低頻超聲結合抗生素可有效增強抗生素治療游離細菌及生物膜細菌感染的活性[24]。Qian等[25]報道了應用低強度超聲輻照銅綠假單胞菌24 h后，發現超聲能顯著增強抗生素活性對抗生物膜，提高其抗菌活性。

3.6 其他 抗體作為一類主要的蛋白質藥物目前應用的較為廣泛，Anti-asialoGM抗體能降低銅綠假單胞菌在肺囊纖維化上皮細胞的粘附[26]。而人類免疫球蛋白IgG能降低銅綠假單胞菌在隱形眼鏡和角膜細胞表面的粘附[27]。段高飛等[28]研究發現一種海洋弧菌胞外多糖，其不僅能夠抑制細菌生物膜的形成，還能破壞逐漸形成的生物膜，增加抗生素對生物膜細菌的殺滅效果，作用更加廣泛。

4 結 語

細菌生物膜存在于慢性感染及植入裝置相關性感染中，盡管人們應用多種方法來防治細菌生物膜感染，并取得了一定的成效，但是隨之而來的是可能會帶來“超級細菌”的出現。因此，隨著對細菌生物膜的深入研究，今后防治生物膜感染的研究方向不應只集中控制細菌生物膜的形成，而應針對細菌生物膜感染的發病過程研究更好的治療方法。

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A

1003—6350（2014）09—1331—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.09.0512

2013-10-21)

溫紹霞。E-mail：2603384011@qq.com