蛋白質(zhì)組學(xué)在急性胰腺炎中研究進(jìn)展

龔騰綜述，夏先明，蘇松審校

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科，四川瀘州 646000)

蛋白質(zhì)組學(xué)在急性胰腺炎中研究進(jìn)展

龔騰綜述，夏先明，蘇松審校

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科，四川瀘州 646000)

隨著人類基因組計(jì)劃取得的巨大成功，生命科學(xué)的研究已實(shí)質(zhì)性地進(jìn)入后基因組時(shí)代，即對(duì)基因功能的研究。蛋白質(zhì)組學(xué)作為基因功能研究的重要工具，已經(jīng)廣泛用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，其發(fā)展迅猛，是因蛋白質(zhì)組學(xué)能夠較為全面的考察蛋白層面的表達(dá)情況，有利于獲得各種蛋白、多肽、因子等信息，從而對(duì)疾病的發(fā)病機(jī)制、診斷和治療進(jìn)行更深入的研究。急性胰腺炎是臨床常見(jiàn)的急腹癥，發(fā)病急驟，病情危重而復(fù)雜，鑒于蛋白質(zhì)組學(xué)的巨大應(yīng)用前景，本文綜述蛋白質(zhì)組學(xué)在急性胰腺炎中的研究進(jìn)展。

蛋白質(zhì)組學(xué)；急性胰腺炎；差異；

急性胰腺炎是臨床常見(jiàn)的急腹癥，發(fā)病急驟，病情危重而復(fù)雜。急性胰腺炎分為輕型和重型，重癥急性胰腺炎的確切機(jī)制至今尚不清楚，病情危重，其病死率高達(dá)30%～40%[1]。因此，探明急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制、確定診斷標(biāo)準(zhǔn)以及早期嚴(yán)重程度判定標(biāo)準(zhǔn)仍是當(dāng)務(wù)之急。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究特點(diǎn)和內(nèi)容給我們提供了一個(gè)全新的思路。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在研究蛋白的復(fù)雜性方面扮演著重要角色[2]，它是以細(xì)胞或組織不同時(shí)間、環(huán)境的所有蛋白質(zhì)為研究對(duì)象，從總體上研究其蛋白的種類，相互作用以及功能結(jié)構(gòu)的方法[3]。它作為一種強(qiáng)大的工具，它不僅可以證實(shí)靶點(diǎn)多肽或蛋白質(zhì)存在與否，而且可以對(duì)上調(diào)或下調(diào)的蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行定量分析，因而我們能通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探討急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制，評(píng)估早期嚴(yán)重程度，并為其轉(zhuǎn)歸和預(yù)后找到特異性的標(biāo)志物。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)組學(xué)是通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的研究，了解蛋白質(zhì)的表達(dá)量、結(jié)構(gòu)及其代謝調(diào)節(jié)，并在蛋白水平上對(duì)血清、細(xì)胞和組織形成全面而深入的認(rèn)識(shí)，了解疾病的發(fā)病機(jī)制、轉(zhuǎn)歸及預(yù)后，同時(shí)也相應(yīng)的帶動(dòng)了新藥開(kāi)發(fā)和醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展。蛋白質(zhì)組研究大致可以分為二類：一類是針對(duì)細(xì)胞或組織所表達(dá)全部蛋白質(zhì)；另一類則是以一個(gè)完整的生物學(xué)機(jī)制或與機(jī)制相關(guān)的全部蛋白質(zhì)為著重點(diǎn)。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容及其相關(guān)技術(shù)

2.1 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容大致包括以下四個(gè)方面：（1）蛋白質(zhì)組成和成分的鑒定、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建、新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)、同源性蛋白質(zhì)之間的比較、蛋白質(zhì)的加工和修飾分析等；(2)蛋白質(zhì)家族功能的異同點(diǎn)、蛋白質(zhì)的生與死、蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物變化等；(3)重要代謝途徑的分子機(jī)制；(4)尋找靶分子、及腫瘤特異標(biāo)記物及新藥靶點(diǎn)等。

2.2 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究流程蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基本路線是制備組織、細(xì)胞等蛋白樣品，然后大規(guī)模分離、分析和鑒定。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究流程大致包括以下四個(gè)方面：(1)確定你將研究的對(duì)象，即有明確可信的模型，如研究某一物種、個(gè)體、器官、組織、細(xì)胞、亞細(xì)胞乃至蛋白質(zhì)復(fù)合體。(2)選取你所需的分離技術(shù)，如1-D、2-D、MS、LC、HPLC等。(3)鑒定蛋白質(zhì)：分離后蛋白質(zhì)須進(jìn)行鑒定，主要的鑒定技術(shù)有質(zhì)譜技術(shù)、EDman降解法、Western blot及氨基酸組成分析等。以質(zhì)譜技術(shù)由于其靈敏度高、快速準(zhǔn)確、易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，已成為蛋白質(zhì)組研究中的主要蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)。

2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的常用技術(shù)目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究最常用的技術(shù)是二維凝膠電泳和質(zhì)譜分析[4-6]以及蛋白芯片技術(shù)。二維凝膠電泳是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)之一，也是使用范圍最廣泛的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，是目前技術(shù)條件下常用的唯一能夠連續(xù)在一塊膠上分離數(shù)千種蛋白質(zhì)的方法，但二維凝膠電泳技術(shù)復(fù)雜，工作流程多，對(duì)分子量很大或者很小的蛋白質(zhì)分離不好。質(zhì)譜技術(shù)可以精確測(cè)量生物的大分子，也可應(yīng)對(duì)小分子生物活性物進(jìn)行定性或定量的分析，并具有準(zhǔn)確、易操作、快速及普適性。蛋白芯片技術(shù)能同時(shí)從微量的樣品中檢測(cè)成千上萬(wàn)個(gè)蛋白質(zhì)或多肽，并且還具有快速、易行、高效等優(yōu)點(diǎn)。

3 急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制

急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，發(fā)生發(fā)展受多個(gè)因素的影響[7-8]，至今仍未被闡述清楚。關(guān)于急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)理學(xué)者們提出了眾多學(xué)說(shuō)，比較有影響的有“胰酶自身消化學(xué)說(shuō)”、“炎癥因子學(xué)說(shuō)”、“氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)”、“細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)”、“胰腺腺泡內(nèi)鈣超載學(xué)說(shuō)”、“腸道細(xì)菌移位學(xué)說(shuō)”、“胰腺微循環(huán)障礙學(xué)說(shuō)”等。綜合以上各種學(xué)說(shuō)，即在急性胰腺炎的發(fā)病早期，各種胰酶通過(guò)不同途徑相繼激活，各種炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子以及大量的氧自由基的產(chǎn)生，繼而引發(fā)全身炎癥反應(yīng)；內(nèi)毒素釋放入血，在通過(guò)細(xì)胞因子的誘導(dǎo)及產(chǎn)生DIC；腸道屏障因各種因素被損壞，腸道細(xì)菌移位，從而引起嚴(yán)重感染，最終引發(fā)多器官功能衰竭。

4 急性胰腺炎的蛋白組學(xué)研究進(jìn)展

自蛋白質(zhì)組[9]概念提出以來(lái)，對(duì)其的研究發(fā)展極其迅猛，不論是基礎(chǔ)理論還是技術(shù)方法，都在不斷進(jìn)步和完善，并且應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)等方面。對(duì)于急性胰腺炎而言，近年來(lái)已逐漸出現(xiàn)其與蛋白組學(xué)相關(guān)研究的報(bào)道：在臨床方面，Papachristou等[10]比較了21例輕癥急性胰腺炎（MAP)與7例重癥急性胰腺炎（SAP)血清蛋白質(zhì)組學(xué)的特點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組AP之間有18個(gè)明顯差異的蛋白點(diǎn)，并且SAP患者血清分子質(zhì)量43 000和117 000的兩個(gè)蛋白質(zhì)明顯不同于MAP，通過(guò)比較證實(shí)其中分子質(zhì)量為117 000的蛋白點(diǎn)對(duì)SAP和MAP的敏感性具有鑒別意義，敏感度為100%，特異度為81%。Flint等[11]則研究了SAP患者尿液中蛋白質(zhì)組學(xué)的特點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SAP患者尿液中有17個(gè)蛋白峰，與MAP對(duì)照組具有明顯的差別，質(zhì)譜分析證實(shí)其有21種差異的蛋白質(zhì)成分。我國(guó)任俊等[12]通過(guò)比較SAP患者在治療前后蛋白質(zhì)組表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)SAP治療前后一共檢測(cè)到血清中的132個(gè)點(diǎn)，其中質(zhì)荷比2 000到40 000間共有27個(gè)差異點(diǎn)，并且相對(duì)分子質(zhì)量為47 000的蛋白質(zhì)在SAP病情緩解后表達(dá)明顯下調(diào)，而相對(duì)分子質(zhì)量為115 000以及159 000的蛋白質(zhì)在SAP患者治療后上調(diào)。在動(dòng)物模型方面，國(guó)內(nèi)Zhang等[13]研究了伴有高脂血癥的SAP的胰腺組織蛋白質(zhì)組學(xué)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)高脂血癥SAP與正常血脂AP組有59個(gè)差異點(diǎn)，并且有39個(gè)差異點(diǎn)經(jīng)質(zhì)譜分析成功鑒定，23個(gè)蛋白質(zhì)在高脂血癥SAP組表達(dá)上調(diào)，16個(gè)點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。而高脂血癥MAP與正常血脂MAP組分析到12個(gè)差異點(diǎn)，7個(gè)差異點(diǎn)經(jīng)質(zhì)譜分析成功鑒定，5個(gè)差異點(diǎn)在高脂血癥MAP表達(dá)下調(diào)，2個(gè)點(diǎn)在高脂血癥MAP中上調(diào)。國(guó)內(nèi)龍有明等[14]觀察用牛黃膽酸鈉誘導(dǎo)的SAP大鼠胰腺組織在各個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)蛋白質(zhì)組學(xué)的變化，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SAP組與假手術(shù)組在24 h時(shí)共有46個(gè)表達(dá)差異的蛋白質(zhì)峰，其中有37個(gè)差異點(diǎn)下調(diào)，9個(gè)差異點(diǎn)上調(diào)。SAP組與假手術(shù)在48 h時(shí)共有97個(gè)差異的蛋白質(zhì)峰，54個(gè)差異點(diǎn)下調(diào)，43個(gè)差異點(diǎn)上調(diào)；在72 h時(shí)SAP組與假手術(shù)組有80個(gè)差異的蛋白質(zhì)峰，其中70個(gè)點(diǎn)下調(diào)以及10個(gè)點(diǎn)上調(diào)。Yang等[15]研究了清胰顆粒對(duì)牛黃膽酸鈉誘導(dǎo)大鼠重癥急性胰腺炎胰腺組織中總蛋白表達(dá)變化的影響，經(jīng)凝膠圖像處理軟件分析胰腺組織蛋白質(zhì)組學(xué)變化，48 h時(shí)兩組有22個(gè)差異點(diǎn)，用藥后5個(gè)點(diǎn)蛋白上調(diào)，17個(gè)點(diǎn)下調(diào)。48 h時(shí)間點(diǎn)比較兩組表達(dá)差異超過(guò)4倍且穩(wěn)定的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)共有9個(gè)，并通過(guò)質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定出這九種蛋白質(zhì)。而Mittal等[16]則研究了大鼠的SAP模型腸系膜淋巴結(jié)蛋白組學(xué)特點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組有245個(gè)差異點(diǎn)，包括了35個(gè)差異點(diǎn)下調(diào)，210個(gè)差異點(diǎn)上調(diào)，并證實(shí)有7種蛋白質(zhì)是胰腺代謝的酶類。García等[17]研究急性胰腺炎早期胰腺細(xì)胞溶酶體蛋白質(zhì)組學(xué)的變化，為急性胰腺炎早期的病理生理研究提供了有價(jià)值的信息。總之，大量研究證實(shí)急性胰腺炎不同類型、不同時(shí)點(diǎn)蛋白表達(dá)存在差異，提示其對(duì)胰腺炎診斷及預(yù)后判定具有重要意義。

5 問(wèn)題與展望

迄今為止急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制未能完全闡明，目前可行的實(shí)驗(yàn)室檢查仍缺乏診斷及評(píng)估其嚴(yán)重程度的金標(biāo)準(zhǔn)，因此揭示急性胰腺炎內(nèi)在發(fā)病機(jī)制，找到診斷和判定其嚴(yán)重程度及預(yù)后的特異性標(biāo)志物迫在眉睫。隨著二維凝膠電泳、質(zhì)譜分析及蛋白芯片等蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)逐步應(yīng)用于急性胰腺炎在血清、組織及胰液等的差異蛋白分析，為進(jìn)一步在分子水平揭示該病發(fā)病機(jī)制，尋找診斷和判定其嚴(yán)重程度及預(yù)后的相關(guān)蛋白質(zhì)提供了可能。雖然蛋白質(zhì)組學(xué)方法在急性胰腺炎中的應(yīng)用依然處在初期階段，需要更深入的探索和研究，但已經(jīng)給我們提供了信息和思路。

[1]邵玉東.清胰湯對(duì)重癥急性胰腺炎治療價(jià)值的系統(tǒng)評(píng)價(jià)[J].中醫(yī)臨床研究,2012,(2):83.

[2]Gundry RL,Tchernyshyov I,Sheng S,et al.Expanding the mouse embryonic stem cell proteome:combining three proteomic approaches[J].Proteomics,2010,10(14):2728～2732.

[3]Simpson RJ,Dorow DS.Cancer proteomics:from signaling networks to tumor markers[J].Trends Biotechnol,2001,19(10 Suppl): S40～S48.

[4]Zabrouskov V,Ge Y,Schwartz J,et al.Unraveling molecular complexity of phosphorylated human cardiac troponin I by top down electron capture dissociation/electron transfer dissociation mass spectrometry[J].Mol Cell Proteomics,2008,7(10):1838～1849.

[5]Drews O,Zong C,Ping P.Exploring proteasome complexes by proteomic approaches[J].Proteomics,2007,7(7):1047-1058.

[6]Fero M,Pogliano K.Automated quantitative live cell fluorescence microscopy[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2010,2(8):a455.

[7]李震東,馬清涌,羅羽宏.Fas/FasL介導(dǎo)的caspase-3活化與急性胰腺炎腺泡細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J].中國(guó)病理生理雜志,2009,25(6):1197-1201.

[8]唐詩(shī)彬,張肇達(dá),吳路楊,等.急性壞死性胰腺炎大鼠白細(xì)胞L-選擇素表達(dá)和肌動(dòng)蛋白分布的變化及中藥華西胰腺炎一號(hào)的影響[J].中國(guó)病理生理雜志,2009,25(7):1381-1385.

[9]Wasinger VC,Cordwell SJ,Cerpa-Poljak A,et al.Progress with gene-product mapping of the Mollicutes:Mycoplasma genitalium [J].Electrophoresis,1995,16(7):1090-1094.

[10]Papachristou GI,Malehorn DE,Lamb J,et al.Serum proteomic patterns as a predictor of severity in acute pancreatitis[J].Pancreatology,2007,7(4):317-324.

[11]Flint RS,Phillips AR,Farrant GJ,et al.Probing the urinary proteome of severe acute pancreatitis[J].HPB(Oxford),2007,9(6): 447-455.

[12]任俊,余開(kāi)煥,馬鵬,等.重癥急性胰腺炎患者治療前后血清蛋白質(zhì)組學(xué)的變化[J].中華胰腺病雜志,2012,12(13):147-149.

[13]Zhang W,Zhao Y,Zeng Y,et al.Hyperlipidemic versus normal-lipid acute necrotic pancreatitis:proteomic analysis using an animal model[J].Pancreas,2012,41(2):317-322.

[14]龍友明,肖小玉,崔淑蘭,等.大鼠重癥急性胰腺炎胰腺蛋白組學(xué)的初步研究[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào),2010,26(3):319-321.

[15]Yang YS,Chen K,Ye S,et al.Differentially expressed proteins of severe acute pancreatitis intervened by Qingyi granule[J].Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi,2013,33(1):60-64.

[16]Mittal A,Phillips AR,Middleditch M,et al.The proteome of mesentericlymph during acute pancreatitis and implications for treatmen t [J].JOP,2009,10(2):130-142.

[17]García-Hernández V,Sánchez-Bernal C,Sarmiento N,et al.Proteomic analysis of the soluble and the lysosomal+mitochondrial fractions from rat pancreas:Implications for cerulein-induced acute pancreatitis[J].Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Proteins and Proteomics,2012,1824(9):1058-1067.

R657.5+1

A

1003—6350（2014）05—0709—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.05.0274

2013-09-24)

夏先明。E-mail：xxm6206@126.com