黃芪多糖對異丙腎上腺素誘導大鼠心肌肥厚中TLR4/NF-κB信號通路的影響

李勝陶， 王洪新， 楊 娟， 魯美麗， 張 靜

(遼寧醫學院心腦血管藥物研究重點實驗室，遼寧 錦州 121001)

黃芪多糖(Polysaccharide fromAstragaliRadix)是中藥黃芪中的主要活性成分之一，也是目前臨床和藥理研究較為深入的中藥成分之一，具有廣泛的免疫調節作用并能改善心臟功能及炎癥抑制作用[1]。最近，關于炎癥信號通路及炎癥因子在心肌肥厚的發生發展過程中的作用越來越受到重視。有研究表明，炎癥因子在促進左心室重構中起到重要作用，包括導致心肌細胞肥大、胚胎基因表達、促進心肌細胞凋亡等[2-3]。Toll樣受體(Toll-like receptors)最突出的生物學功能是促進細胞因子的合成與釋放，引發炎癥反應[4]。Toll 樣受體是心血管疾病發展與免疫系統之間的橋梁，其中TLR4被認為與人類心血管疾病關系最為密切[5-6]，TLR4是介導心肌肥厚炎癥信號的重要受體，TLR4的活化可使NF-κB的表達增加，進而引起一系列炎性因子的表達，相反NF-κB的活性對TLR4也具有調節作用[7]。Serra等[8]研究發現，異丙腎上腺素(Isoprenaline，ISO)誘導心肌肥厚可使心肌組織中TNF-α和IL-6的基因表達增加，同時也使NF-κB表達增加。但異丙腎上腺素誘導心肌肥厚的過程中，TLR4表達是否增加目前尚無報道。已有研究證實黃芪多糖對異丙腎上腺素誘導乳鼠心肌細胞肥大有保護作用[9]。然而黃芪多糖對異丙腎上腺素誘導心肌肥厚的保護作用是否通過阻斷TLR4/NF-κB通路這一途徑，目前尚無報道。本實驗運用異丙腎上腺素制作心肌肥厚模型，探討TLR4/NF-κB通路在黃芪多糖保護心臟過程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥品和試劑 健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄不限，4～6 周齡，體質量180～200 g，由遼寧醫學院實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(遼)20030007。黃芪多糖購自陜西森弗生物技術有限公司(批號HQ090312)，純度為98%；異丙腎上腺素、普萘洛爾(美國 Sigma 公司)，TNF-α和IL-6 ELISA 試劑盒均購自 R&D 公司；TLR4一抗、IκBα一抗(北京博奧森生物技術有限公司)和p65一抗(美國Proteintech Group公司)；Trizol試劑、RT-PCR 試劑盒購自大連寶生物公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 動物模型制備、實驗分組和給藥方法 SD大鼠60只，隨機分為6組(每組10只):對照組，異丙腎上腺素組，異丙腎上腺素+黃芪多糖200 mg/(kg·d)組，異丙腎上腺素400 mg/(kg·d)組，異丙腎上腺素800 mg/(kg·d)組，異丙腎上腺素+普萘洛爾40 mg/(kg·d)組。給藥組連續腹腔注射3周，并于給藥1 d后腹腔注射異丙腎上腺素 5 mg/(kg·d)2周；正常對照組和異丙腎上腺素組大鼠都給予相同體積的生理鹽水。

1.3 心臟質量參數測定 麻醉后迅速開胸，去血清置于-20 ℃ 冰箱保存。抽取血標本后取出心臟，修剪周圍組織和血管，稱量全心質量(Heart weight，HW)和左心室質量(Left ventricle weight，LVW)。計算全心質量指數(Heart mass index，HMI=HW/BW)和左室質量指數(Left ventricle mass index ，LVMI=LVW/BW)。

1.4 HE染色檢測心肌組織改變 橫向取甲醛固定好的左心室心肌部分約0.5 cm，常規石蠟包埋、切片(5 μm)，HE染色后，光鏡下觀察心肌組織形態學變化。

1.5 RT-PCR法檢測心肌組織 ANP 和 TLR4 mRNA的表達 取約100 mg心肌組織，用TRIzol 法提取心肌組織總 RNA，取約1 μg總 RNA，進行逆轉錄。逆轉錄條件：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min。ANP引物：上游引物GGG CTC CTT CTC CAT CAC，下游引物CCC TCA GTT TGC TTT TCA(344 bp)。TLR4引物：上游引物CTA TCA TCA GTG TAT CGG TG, 下游引物CAG TCC TCA TTC TGG CTC(186 bp)。內參GAPDH的引物序列上游引物AAT GCA TCC TGC CAC CAC CAA CTG C, 下游引物GGA GGC CAT GTA GTA GGC CAT GAG GTC(550 bp)。PCR反應條件：94 ℃ 45 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min 15 s。電泳結束后，取置于凝膠成像系統進行觀察，用凝膠圖像分析系統軟件對 RT-PCR 產物電泳條帶進行密度分析，以 GAPDH 為內參，根據心鈉素(ANP)、TLR4和GAPDH密度分析結果比值，計算得到ANP、TLR4的相對表達量。

1.6 Western Blot 法測定心肌組織TLR4、p65和IκBα蛋白表達 選取心肌組織放于無菌EP管中，加入裂解緩沖液(RIPA)，提取總蛋白。蛋白定量(BCA) 法進行蛋白濃度測定，灌膠上樣進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，觀察標記移動情況，根據所需適時終止電泳。取出電泳凝膠進行轉膜，然后將得到的PVDF膜浸入封閉液置于搖床上緩慢搖1 h以上，洗膜，切割后分別按照對應分子量置于稀釋過的TLR4、p65和IκBα一抗溶液中，4 ℃ 雜交過夜，用洗膜液漂洗后加入稀釋的二抗，搖床上雜交 1 h，然后取出用洗膜液沖洗，然后加ECL顯色，上機檢測。

1.7 ELISA 法檢測大鼠血清 TNF-α、IL-6水平 備好“1.3”項步驟中的血清標本，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 法檢測大鼠血清TNF-α、IL-6蛋白濃度。在無菌條件下按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

2 結果

2.1 不同處理因素對大鼠心臟指數的影響 表1結果顯示，與對照組相比較，異丙腎上腺素組大鼠的HMI和LVMI分別增加了37.40%、35.35%(P<0.01)，表明大鼠心肌肥厚模型成功，心臟整體形態發生改變。同異丙腎上腺素組相比較，黃芪多糖400、800 mg/(kg·d)和普萘洛爾40 mg/(kg·d)組大鼠HMI和LVMI明顯降低(P<0.05，P<0.01)，說明黃芪多糖可有效減輕異丙腎上腺素所致的心肌肥厚。

表1 不同處理因素對大鼠HMI和LVMI的影響

2.2 不同處理因素對大鼠心肌病理變化的影響 HE染色切片在顯微鏡下觀察，對照組心肌細胞形態均勻，心肌纖維排列整齊(圖1A)。異丙腎上腺素組心肌細胞較寬大，肌束纖維排列紊亂且疏松水腫，界限不清，且有局灶性壞死，肌束內可見局灶性纖維組織增生，間質可見炎癥細胞浸潤(圖1B)。與異丙腎上腺素組相比較，黃芪多糖 200 mg/(kg·d)組心肌纖維未見恢復(圖1C)；黃芪多糖400 mg/(kg·d)組心肌纖維部分恢復，但仍見少部分區域心肌纖維腫脹，肌纖維紊亂程度減輕，間質中炎癥細胞浸潤減少(圖1D)；黃芪多糖800 mg/(kg·d)組和普萘洛爾40 mg/(kg·d)組心肌纖維恢復良好，排列恢復整齊，形態基本保持一致(圖1E、1F)。

2.3 心肌組織ANP、TLR4 mRNA的表達 心鈉素(Atrial natriuretic peptide，ANP)是心肌肥大的標志性基因之一，通常肥大的心肌組織較正常心肌組織中ANP mRNA表達增加。 圖2所示為各組大鼠心肌組織ANP、TLR4 mRNA的表達水平。同對照組相比，異丙腎上腺素組大鼠心肌組織ANP、TLR4mRNA表達分別增加了44.27%、60.12%(P<0.01)。與異丙腎上腺素組相比，黃芪多糖各劑量組和普萘洛爾40 mg/(kg·d)組ANP、 TLR4 mRNA的表達減少，差別有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。表明黃芪多糖對異丙腎上腺素誘導的心肌肥厚有保護作用，其可能是通過抑制TLR4 mRNA 的表達。

圖1 不同處理因素對大鼠心肌病理變化的影響(HE×400)

注：與對照組比較，**P<0.01；與異丙腎上腺素組相比較，#P<0.05，##P<0.01 1.對照組 2.異丙腎上腺素組 3.異丙腎上腺素+黃芪多糖 200 mg/(kg·d) 4.異丙腎上腺素+黃芪多糖400 mg/(kg·d)組5. 異丙腎上腺素+黃芪多糖800 mg/(kg·d)組 6.異丙腎上腺素+普萘洛爾40 mg/(kg·d)組

2.4 心肌組織TLR4、p65和IκBα蛋白的表達 圖3所示為各組大鼠心肌組織TLR4、p65和IκBα蛋白的表達水平。與對照組相比，異丙腎上腺素組TLR4、p65表達水平分別增加，IκBα 表達水平減少(P<0.01)。與異丙腎上腺素組相比，黃芪多糖各劑量組和普萘洛爾40 mg/(kg·d)組TLR4、P65表達水平分別減少，IκBα 表達水平升高(P<0.05，P<0.01)。表明黃芪多糖可能通過抑制IκBα 降解，抑制TLR4、 p65 的表達而保護心臟。

注：與對照組比較，**P<0.01；與異丙腎上腺素組相比較，#P<0.05，##P<0.01 1.對照組 2.異丙腎上腺素組 3.異丙腎上腺素+ 黃芪多糖 200 mg/(kg·d) 4.異丙腎上腺素+ 黃芪多糖400 mg/(kg·d) 5.異丙腎上腺素+ 黃芪多糖800 mg/(kg·d) 6.異丙腎上腺素+普萘洛爾40 mg/(kg·d)

2.5 大鼠血清中TNF-α、IL-6 的表達 表2為大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6表達的情況。同對照組相比較，異丙腎上腺素組大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6水平明顯增加(P<0.01)。與異丙腎上腺素組相比，黃芪多糖 400 mg/(kg·d)組、黃芪多糖800 mg/(kg·d)組和普萘洛爾組 40 mg/(kg·d) 組能夠明顯減少大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6的水平(P<0.01)；黃芪多糖200 mg/(kg·d)組能夠減少血清中炎癥因子TNF-α的水平(P<0.05)。與黃芪多糖200 mg/(kg·d)組相比較，黃芪多糖400、800和普萘洛爾40 mg/(kg·d)組TNF-α、IL-6的水平明顯降低(P<0.01)，并且炎癥因子TNF-α、IL-6的水平隨著黃芪多糖的劑量遞增而呈遞減趨勢，即黃芪多糖對炎癥因子的抑制作用呈劑量依賴性，表明黃芪多糖可以通過抑制炎癥因子TNF-α、IL-6的表達來保護心肌。

表2 不同處理因素對大鼠血清中TNF-α和IL-6 表達的影響

3 討論

心肌肥厚是眾多心血管疾病共同的病理過程，研究發現肥厚的心肌中存在嚴重的炎癥反應，而一系列的炎癥應答會加重心肌損害，從而引起心肌收縮功能障礙及心肌重構，最終會導致心力衰竭[10]。有研究表明抑制心臟的炎癥反應可以有效防止心肌肥厚并減緩心衰的發展[11]。導致心肌肥厚的信號通路[12]如MAPK通路、Ca2+及其依賴的信號通路、JAK/STAT信號通路等，目前針對這些信號通路的藥物及治療策略對心臟疾病的療效與對死亡率的控制已經不能再進一步改善與提高。而有離體實驗[13-14]針對TLR4/NF-κB這一炎癥信號通路的研究發現，黃芪多糖可以減緩TNF-α、脂多糖(LPS)誘導心肌細胞肥大中的炎癥因子的表達。有動物實驗研究表明[15]，阻斷NF-κB后，TLR4在腎性高血壓大鼠肥厚心肌中表達減少。所以研究黃芪多糖對異丙腎上腺素誘導大鼠心肌肥厚中TLR4/NF-κB的影響具有重要意義。

本實驗結果顯示，黃芪多糖可以抑制異丙腎上腺素誘導的心肌肥厚，并且黃芪多糖800 mg/(kg·d)組與普萘洛爾組對心肌肥厚的保護作用相似。心臟質量參數測定結果顯示異丙腎上腺素組大鼠全心質量指數和左心室質量指數分別增加了37.40%、35.35%；在400倍顯微鏡下觀察心肌組織HE染色，發現異丙腎上腺素組心肌細胞增粗，肌束纖維排列紊亂且疏松水腫，界限不清，間質可見炎癥細胞浸潤；心肌肥厚基因ANP mRNA的表達顯著增加，說明大鼠心肌肥厚模型成功。而黃芪多糖800 mg/(kg·d)組能有效對抗這些改變。從RT-PCR對心肌組織TLR4 mRNA檢測水平來看，異丙腎上腺素組較對照組的表達水平明顯增加，而在黃芪多糖和普萘洛爾組TLR4 mRNA的水平降低。通過Western Blot檢測心肌組織TLR4、p65和IκBα蛋白水平結果來看，異丙腎上腺素組大鼠心肌組織TLR4、p65蛋白表達增加，而IκBα蛋白表達降低，黃芪多糖和普萘洛爾組的結果與之相反。ELISA 的結果顯示，異丙腎上腺素能引起大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6增多，黃芪多糖 800 mg/(kg·d)組和普萘洛爾組抑制炎癥因子的作用相似，并且炎癥因子TNF-α、IL-6的水平隨著黃芪多糖的劑量遞增而呈遞減趨勢，即黃芪多糖對炎癥因子的抑制作用呈劑量依賴性，表明黃芪多糖可以通過抑制炎癥因子TNF-α、IL-6的表達來保護心肌組織。

綜合以上實驗結果，說明黃芪多糖能抑制異丙腎上腺素誘導的心肌肥厚，能抑制TLR4、p65的表達和IκBα的降解，即黃芪多糖可能是通過抑制TLR4/NF-κB這一信號通路的激活來減緩組織中的炎癥因子的分泌，從而保護心臟。但其具體機制還有待進一步證實，黃芪多糖用于臨床心血管疾病的治療以及與普萘洛爾對照的療效都需進一步實驗探討。

參考文獻：

[1] Li S G, Zhang Y Q, Zhao J X. Preparation and suppressive effect of astragalus polysaccharide in glomerulonephritis rats[J].IntImmunopharmaco, 2007, 7(1): 23-28.

[2] Hedayat M, Mahammadi M J, Hedayat M,etal. Proinflammatory cytokines in heart failure: double edged swords[J].HeartFailRev,2010,15(6):543-562.

[3] Kleinbongard P, Schulz R, Heusch G. TNF-α in myocardial ischemia/reperfusion, remodeling and heartfailure[J].HeartFailRev,2011, 16(1):49-69.

[4] Akira S,Uemalsu S,Takeuchi O. Pathogen recognition and innate immunity[J].Cell,2006, 124(4):783-801.

[5] 朱文敏. Toll樣受體與心血管疾病[J].國際心血管雜志，2008,35(6):377-379.

[6] Ding G, Cheng L, Qin Q,etal. PPARalpha modulates lipopolysaccharide induced TNF-α inflammation signaling in cultured cardiomyocytes[J].MolCellCardiol,2006, 40(6):821-828.

[7] Frantz S , kobzik L, Kim Y,etal. TLR4 expression in cardiac myocytes in normal and failing myocardium [J].JClinInvest,1999, 104(3): 271-280.

[8] Serra A J, Santos M H, Bocalini D S，etal. Exercise training inhibits inflammatory cytokines and more than prevents myocardial dysfunction in rats with sustained β-adrenergic hyperactivity [ J ].Physiol, 2010,588(Pt 13):2431-2442.

[9] 趙素玲，王洪新，周振華. 黃芪多糖對異丙腎上腺素誘導的乳大鼠心肌細胞肥大的保護作用[ J ].中國藥理學通報, 2011,27(12):1682-1686.

[10] Rohini A, Agrawal N, Koyani C N,etal.Molecular targets and regulators of cardiac hypertrophy[J].PharmacolRes,2010 ,61(4):269-280.

[11] Gupta S, Young D, Maitra R K,etal. Prevention of cardiac hypertrophy and heart failure by silencing of NF-kappaB[J].JMolBiol,2008,375(3):637-649.

[12] 劉麗娜，李法琦.心肌肥厚相關信號通路的研究進展[J]. 重慶醫學,2010,39(20): 2805-2808.

[13] 梁靈君，王洪新，孫雪芳，等. Toll樣受體4/NF-κB信號通路參與黃芪多糖對腫瘤壞死因子-α誘導的乳大鼠心肌細胞肥大的抑制作用[J]. 中國藥理學與毒理學雜志，2013,27(2):44-49.

[14] 孫雪芳，王洪新，粱靈君.黃芪多糖通過TLR4/NF-κB信號通路抑制脂多糖誘導的大鼠心肌細胞肥大[J].中國藥理學通報 ,2013,29(2):208-211.

[15] 王季文，曲 鵬，姜 華.抑制NF-κB對Toll樣受體4在Goldblatt鼠左室心肌中表達的影響[J].高血壓雜志,2005, 13(7): 427-431.