沙苑子總黃酮和百草酸的體內(nèi)外抗腫瘤作用

白 勇, 孫安盛， 吳 芹

(1.貴州遵義醫(yī)學(xué)院藥理教研室，貴州 遵義 563003； 2.鄭州市衛(wèi)生學(xué)校藥理教研室，河南 鄭州 450005)

腫瘤目前已經(jīng)超過(guò)心血管疾病成為致人死亡的第一殺手，在發(fā)達(dá)國(guó)家和我國(guó)的大中城市，腫瘤的發(fā)病率也在逐年提高[1]。預(yù)防和治療癌癥,仍是我們關(guān)注的課題。當(dāng)前從傳統(tǒng)醫(yī)藥特別是中草藥中尋找多靶點(diǎn)、毒副作用小的抗腫瘤藥物已成為國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥學(xué)專家關(guān)注的焦點(diǎn)。

作為我國(guó)目前研究較多的中藥代表沙苑子總黃酮和百草酸，兩者的許多藥理作用都受到了關(guān)注。沙苑子為豆科植物扁莖黃芪AstraguluscomplanatusR.Br干燥成熟的種子。具有溫補(bǔ)肝腎、固精、縮尿、益肝明目的功能。藥理研究沙苑子總黃酮(flavonoids extracts fromAstragalicomplanatiSemen)具有改善血液流變學(xué)指標(biāo)、降低血壓、調(diào)節(jié)血脂、抑制血小板聚集、保護(hù)肝臟、增強(qiáng)免疫功能、抗炎、鎮(zhèn)痛及調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用[2]。百草酸主要成分為熊果酸 (ursolic acid)，具有鎮(zhèn)靜、抗炎、抗菌、抗?jié)儭⒔档脱恰⒖寡趸裙δ躘3]。目前對(duì)上述兩種藥物報(bào)道的沙苑子總黃酮和百草酸對(duì)體內(nèi)外的抗腫瘤作用，并初探其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 藥品、細(xì)胞、試劑和儀器 沙苑子總黃酮由蘇州中藥所植化室提供；百草酸由上海師范大學(xué)楊慶堯教授提供，其中體內(nèi)使用的熊果酸水平為87%，體外使用的熊果酸純度99.5%；環(huán)磷酰胺(上海華聯(lián)制藥有限公司)，國(guó)藥準(zhǔn)字H31021703，批號(hào)060107，200 mg/瓶；羥基喜樹堿(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司)，國(guó)藥準(zhǔn)字H23022626，批號(hào)050901A，2 mL 1支，2 mg/支。S180肉瘤細(xì)胞來(lái)自蘇州大學(xué)藥理學(xué)教研室。人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所的細(xì)胞庫(kù)。MTT(南京興生生物)；RT 試劑(大連寶生物公司)；P53、Bcl-2、Bax及β-actin的引物由大連寶生物設(shè)計(jì)(表1)，上海皓嘉生物科技有限公司合成，由TaKaRa生物工程公司合成。二甲基亞砜(DMSO)(上海化學(xué)試劑廠)；生產(chǎn)RNA 逆轉(zhuǎn)錄儀(德國(guó)Eppendorf公司)；PCR熱循環(huán)儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；電子天平(北京賽多利斯電子有限公司)；倒置顯微鏡(美國(guó)Napco公司)。

表1 各基因的引物序列

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組及藥物的配制 昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，120只，清潔級(jí)，由蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：XCYK(蘇)2002-0008，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(蘇)2002-0037。飼養(yǎng)環(huán)境的室溫控制在20～25 ℃，室內(nèi)安靜，每日光照12 h，動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水。隨機(jī)分為11組，每組小鼠10只，分別為：(1)模型組；(2)環(huán)磷酰胺25 mg/kg組；(3)羥基喜樹堿5 mg/kg組；(4)沙苑子總黃酮50 mg/kg組；(5)沙苑子總黃酮100 mg/kg組；(6)沙苑子總黃酮200 mg/kg組；(7)沙苑子總黃酮400 mg/kg；(8)百草酸50 mg/kg組；(9)百草酸100 mg/kg組；(10)百草酸200 mg/kg組；(11)百草酸400 mg/kg組[4-6]。由于沙苑子總黃酮易溶于水，百草酸不溶于水，兩種藥分別制成溶液和混懸液，環(huán)磷酰胺用生理鹽水溶解，灌胃給藥。MTT溶液：取適量MTT溶于PBS中，使其終質(zhì)量濃度為5 mg/mL，過(guò)濾除菌，分裝，避光保存。

1.3 動(dòng)物模型的制備、給藥及處理 抽取S180肉瘤小鼠腹腔的腹水，用生理鹽水以1∶4比例混勻，記數(shù)按(2～4)×106/只接種數(shù)接種在小鼠的右側(cè)腋窩皮下[7]。小鼠接種S180肉瘤腹水后的第2天，稱定質(zhì)量，每日按0.2 mL/10 g體質(zhì)量分別灌服給藥模型組灌服蒸餾水；環(huán)磷酰胺對(duì)照組每日按0.2 mL/10 g體質(zhì)量分別灌服環(huán)磷酰胺；給藥組隔天稱定質(zhì)量連續(xù)給藥10 d，羥基喜樹堿對(duì)照組每日按0.1 mL/10 g腹腔注射，隔天1次，第11天各組小鼠稱定質(zhì)量后頸椎脫臼處死，剝?nèi)∧[瘤、脾臟、胸腺并稱定質(zhì)量[8]。

相關(guān)的計(jì)算公式：體內(nèi)抑瘤率[9](inhibitive rate of tumorinvivo)=(1-給藥組瘤定質(zhì)量/模型組瘤定質(zhì)量)×100%；胸腺指數(shù)及脾指數(shù)計(jì)算公式[10]：胸腺指數(shù)(Thymus index, TI)=胸腺質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)；脾指數(shù)(Spleen index,SI)=脾質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.4 腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)、接種、給藥及抑制率檢測(cè) SW620細(xì)胞5×105個(gè)/mL懸液，置于L-15培養(yǎng)液，培養(yǎng)液含10% FBS，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng), 隔日換液，3～4 d傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腫瘤細(xì)胞5×105個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，100 μL/孔。24 h后加入不同質(zhì)量濃度熊果酸(10、20、30、40、50 μmol/L)[11-12]， 對(duì)照組加0.6%DMSO，每組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，取其均值計(jì)算增殖抑制率, 并求其IC50，離心后吸凈上清，每孔加入100 μL DMSO，輕微震蕩10 min，待結(jié)晶充分溶解，于酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)490 nm)檢測(cè)吸光度A值。分別檢測(cè) 12、24、36、48、72 h的A值，以時(shí)間為橫軸，A值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=[(A對(duì)照組-A實(shí)驗(yàn)組)/A對(duì)照組] × 100%

1.5 相關(guān)基因的mRNA表達(dá)測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW620細(xì)胞，分為DMSO對(duì)照組，熊果酸40 μmol/L組(分別處理3、6、12、24、48 h)。按Trizol試劑盒說(shuō)明提取細(xì)胞總mRNA，收集細(xì)胞加入1 mL Trizol液，勻漿，室溫靜置10～15 min，使細(xì)胞完全破壁。取勻漿轉(zhuǎn)入Eppendorf管中，加入三氯甲烷0.2 mL，劇烈震蕩15 s，室溫靜置 2～3 min，4 ℃離心12 000 r/min×15 min，轉(zhuǎn)移上層無(wú)色水相至另一Eppendorf管中。加入 0.5 ml 異丙醇，混勻，室溫靜置10 min; 4 ℃離心12 000 r/min×10 min，棄上清，75%乙醇洗滌沉淀一次，4 ℃離心7 500 r/min×5 min，室溫干燥沉淀5 min，取適量DEPC水溶解沉淀，并在室溫靜置10 min，使沉淀完全溶解，分裝后-80 ℃保存?zhèn)溆谩y(cè)定制備mRNA樣本的OD260/280的比值及進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)mRNA的純度和完整性，并根據(jù)其來(lái)定量。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系: 5×primescriptTMBuffer(for Real Time) 2.0 μL；primescriptTMRT Enzyme Mix 0.5 μL；Oligo(dT)premier(50 μM) 0.5 μL；Random 6 mers(100 μmol/L) 0.5 μL；Total RNA 1.0 μL；Rnase Free dH2O 5.5 μL；Total 10.0 μL)，加以上試劑的操作均在冰盒上進(jìn)行，然后在儀器中逆轉(zhuǎn)錄(兩步法：時(shí)間分別為15 min 30 s)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果

2.1 沙苑子總黃酮和百草酸對(duì)體內(nèi)腫瘤的影響 分組時(shí)及術(shù)前各組小鼠的體質(zhì)量無(wú)差異，各組均長(zhǎng)出腫瘤，說(shuō)明造模成功，環(huán)磷酰胺組在造模后7 d和10 d各死亡1只，環(huán)磷酰胺組對(duì)胸腺有明顯的促進(jìn)作用(P<0.05)，羥基喜樹堿組對(duì)脾臟有明顯的促進(jìn)作用(P<0.05)，均無(wú)明顯抑制作用通過(guò)與模型組和陽(yáng)性組比較可以得出，沙苑子總黃酮和百草酸對(duì)S180肉瘤小鼠均有抑制作用，百草酸的抑制作用更加明顯(P<0.05)。上述兩藥對(duì)胸腺和脾臟均無(wú)明顯抑制作用(P>0.05)(表2)。

表2 沙苑子總黃酮和百草酸對(duì)小鼠S180腫瘤的作用

2.2 沙苑子總黃酮和熊果酸對(duì)體外腫瘤細(xì)胞的影響 倒置下觀察, 正常對(duì)照組細(xì)胞呈梭形，生長(zhǎng)良好，且融合形成集落(圖1-a)。熊果酸作用24 h后，細(xì)胞死亡增多(圖1-b)。加入熊果酸30～50 μmol/L對(duì)SW620細(xì)胞增殖產(chǎn)生明顯的抑制作用，且呈時(shí)間、質(zhì)量濃度依賴性，熊果酸10，20 μmol/L未見(jiàn)沒(méi)有明顯影響(表3)。IC50計(jì)算軟件(1.00版本)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，熊果酸作用24、48、72 h的IC50分別為43.58、31.57、27.86 μmol/L。

圖1 SW620細(xì)胞(24 h×400)

表3 熊果酸對(duì)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞增殖的抑制作用

2.3 總mRNA提取結(jié)果分析 提取的熊果酸(40 μmol/L)作用的SW620的mRNA，先用25 μL DEPC水溶解后，取 2 μL 加水稀釋后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各樣本總RNA在波長(zhǎng)260與280 nm處的OD值，OD260/280比值在1.8以上，表明抽提的RNA純度較高，無(wú)DNA污染(表4)。取 3 μL 加適量的溴芬蘭在含EB的1%瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣，110 V電壓下電泳15 min，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。可見(jiàn)明亮清晰的28 S 和18 S兩條RNA帶，說(shuō)明提取的mRNA完整(圖2)。

表4 提取SW620細(xì)胞mRNA的質(zhì)量和可信度

圖2 提取的總mRNA在1%瓊脂糖凝膠上的條帶

沙苑子總黃酮對(duì)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用(P>0.05)，而熊果酸卻能明顯的抑制該腫瘤細(xì)胞(P<0.05)；熊果酸顯著上調(diào)促凋亡基因P53和Bax的表達(dá)(P<0.05)，下調(diào)抑凋亡基因Bcl-2的表達(dá)(P<0.05)(圖3)。

注：與對(duì)照組比較

3 討論

有研究證實(shí)沙苑子總黃酮和百草酸有抗腫瘤的作用[13-14]，通過(guò)對(duì)相關(guān)報(bào)道的深入研究，為開(kāi)發(fā)利用傳統(tǒng)中藥奠定基礎(chǔ)。本研究采用通過(guò)體內(nèi)體外篩選上述兩藥對(duì)腫瘤的作用，體內(nèi)通過(guò)S180肉瘤模型證實(shí)了沙苑子總黃酮具有一定的抗腫瘤作用(僅200 mg/kg，抑制率23.52%<30%；400 mg/kg，抑制率41.67%>30%)，而百草酸具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用(50 mg/kg，抑制率37.34%>30%；100 mg/kg，抑制率42.32%>30%)，體外抗腫瘤模型從兩藥對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的作用證實(shí)了熊果酸抗腫瘤作用明顯(40～50 μmol /L，>24 h)，其機(jī)制至少與上調(diào)凋亡基因P53和Bax、下調(diào)Bcl-2等抑凋亡基因的mRNA表達(dá)有關(guān)。沙苑子總黃酮無(wú)體外的抗腫瘤作用。分析沙苑子總黃酮在體內(nèi)有一定抗腫瘤作用，在體外抗腫瘤作用不明顯，其原因可能與沙苑子總黃酮本身的性質(zhì)有關(guān)，該藥是含有多種成分的中成藥，對(duì)具體的相關(guān)成分的作用和含量研究不明確，它所表現(xiàn)的作用其實(shí)是多種成分共同作用的結(jié)果，這些成分在腫瘤相關(guān)因素中有抑制腫瘤和誘發(fā)腫瘤的兩方面，該批次的沙苑子總黃酮有一定的體內(nèi)作用但是不明顯，說(shuō)明抑制腫瘤和誘發(fā)腫瘤的綜合作用基本達(dá)到平衡。由此，本課題組考慮在以后的研究中通過(guò)改進(jìn)藥物制備技術(shù)和方法，保留更多的抗腫瘤成分，去掉一些誘發(fā)腫瘤發(fā)生的成分，當(dāng)然這中間還有很多工作去做，比如，查閱或研究沙苑子總黃酮相關(guān)成分的含量和藥理作用，為最終藥物相關(guān)成分的取舍奠定基礎(chǔ)，從而得到理想的抗腫瘤中成藥。

百草酸中含有最多的成分是熊果酸，人們通過(guò)對(duì)熊果酸單體的研究證實(shí)了它在體內(nèi)外的都有明顯的抗腫瘤作用，這樣就很容易理解為何百草酸在體內(nèi)外都有明顯的抗腫瘤作用了。

通過(guò)對(duì)上述兩種中成藥體內(nèi)外抗腫瘤作用的研究，發(fā)現(xiàn)要特別注意中成藥中主要成分的藥理作用，要想得到穩(wěn)定而有效的中成藥，必須要非常注意藥物的制備技術(shù)、方法與各種相關(guān)成分的作用所達(dá)到效果的關(guān)系。只有有目的的取舍，才能夠朝著目標(biāo)邁進(jìn)。

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