黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜對(duì)含藥小鼠血清體外抗病毒作用

姚 干， 王 允， 劉 毅， 陶 勇， 代文飛， 王 皓， 劉 恒

(重慶郵電大學(xué)生物信息學(xué)院，重慶 400065)

黃芩、梔子是常用的清熱解毒類中藥，現(xiàn)代對(duì)其活性成分的研究報(bào)道較多[1-3]。黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物，具有抗菌、抗病毒、解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎等作用，臨床上可用于治療上呼吸道感染[4-6]。本研究采用A549細(xì)胞制作細(xì)胞病理模型，結(jié)合血清藥理學(xué)和細(xì)胞藥理學(xué)方法及技術(shù)，觀察黃芩總黃酮、梔子總環(huán)烯醚萜苷及其組合物含藥血清的體外抗H1N1作用，以期對(duì)黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物抗病毒作用機(jī)制的闡釋提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 病毒株與細(xì)胞株 甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株A/PR/8/34(H1N1)，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心。9日齡雞胚尿囊腔連續(xù)傳代2次，血凝滴度為1∶512。人肺腺癌細(xì)胞株A549，武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動(dòng)物 KM種小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究室(許可證號(hào):310101001)。

1.3 藥物 黃芩總黃酮[7](純度97%，含黃芩苷80%，1 g相當(dāng)于生藥14.5 g)、梔子總環(huán)烯醚萜苷[8](純度84%，含梔子苷62%，1 g相當(dāng)于生藥20.0 g)、黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物[6](以3∶1的質(zhì)量比例組成)，由本實(shí)驗(yàn)室制備,臨用前用蒸餾水分別制成質(zhì)量濃度為13.8、10.0、12.6 mg/mL的藥液,必要時(shí)少量Tween-80助溶。利巴韋林片(四川美大康藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)110405，規(guī)格：0.1g/片)，臨用前用蒸餾水制成質(zhì)量濃度為1.875 mg/mL的藥液。

1.4 試劑 DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS)，Invitrogen公司；胰蛋白酶，GIBCO公司；二甲基亞砜(DMSO),SIGMA公司；Hank＇s平衡緩沖溶液,Thermo Scientific公司；戊巴比妥鈉,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海)。

1.5 儀器 Napco-5100型CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)；550型酶標(biāo)儀，Bio-Rad，美國(guó)；生物安全柜，上海榮能；倒置顯微鏡，LEICA，德國(guó)。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于玻璃培養(yǎng)瓶中，加入10%FBS-DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2孵育。細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后，0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL。

2.2 含藥血清制備 取小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半。各組按40 mL/kg灌胃給藥，連續(xù)6 d。其中，生理鹽水組給予生理鹽水，利巴韋林組給予利巴韋林75 mg/kg，黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物組給予黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物504 mg/kg，黃芩總黃酮組給予黃芩總黃酮552 mg/kg，梔子總環(huán)烯醚萜苷組給予梔子總環(huán)烯醚萜苷400 mg/kg。末次給藥后1 h，深度麻醉,心臟無(wú)菌采血，3 000 r/min離心10 min，同組血清混合，56 ℃水浴30 min，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,EP管分裝,0.5 mL/支,-80 ℃冰箱保存。

2.3 含藥血清的細(xì)胞毒性界限(TC0)測(cè)定[9-10]細(xì)胞接種于96孔板中，100 μL/孔，加入10%FBS-DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)至單層細(xì)胞，棄去原培養(yǎng)液，Hank＇s液洗2次。用10% FBS-DMEM培養(yǎng)液將空白血清和含藥血清做1∶2～1∶64倍比稀釋，分別加入細(xì)胞中，150 μL/孔，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照，37 ℃、5%CO2孵育，每日觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，連續(xù)3 d，與空白細(xì)胞相比，以細(xì)胞不出現(xiàn)退變、變形、脫落的最小稀釋度為含藥血清的無(wú)毒界限(TC0)。結(jié)果見表1。

表1 空白血清及含藥血清對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(n=3)

從表1可以看出，空白血清和含藥血清的稀釋比例分別在1∶4和1∶8以上時(shí)，對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)影響，故確定含藥血清對(duì)細(xì)胞的無(wú)毒界限(TC0)為1∶8。

2.4 病毒的半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(TCID50)測(cè)定[9-10]96孔板中，細(xì)胞長(zhǎng)成薄單層后，傾去原培養(yǎng)液，Hank＇s液洗2次。病毒解凍后，用DMEM培養(yǎng)液稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-66個(gè)稀釋度，分別接種于細(xì)胞上，100 μL/孔，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5%CO2孵育，1 h后棄去原培養(yǎng)液，Hank＇s 液洗2次，加入10% FBS-DMEM培養(yǎng)液150 μL/孔，隨行細(xì)胞對(duì)照。37 ℃、5%CO2孵育，48～72 h內(nèi)倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的病變(CPE)情況，Reed-Muench法計(jì)算TCID50。結(jié)果見表2。

表2 病毒對(duì)A549細(xì)胞的致病變作用(n=3)

從表2可以看出，接種病毒后，細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的病變，并隨病毒液稀比例(10-4～10-1)的增加而增強(qiáng)。根據(jù)表2中細(xì)胞的病變情況，采用Reed-Muench法計(jì)算，得到病毒的TCID50為10-2.9/0.1 mL。

2.5 含藥血清對(duì)病毒細(xì)胞內(nèi)增殖的影響[11-12]實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞病變效應(yīng)法(Cytopathogenic effect, CPE)。96孔板中，細(xì)胞長(zhǎng)成薄單層后，傾去原培養(yǎng)液，Hank＇s液洗2次后，加入20倍量TCID50病毒攻擊，100 μL/孔，37 ℃、5%CO2孵育，1 h后棄去原病毒液，Hank＇s 液洗2次，加入含藥血清或空白血清，150 μL/孔，每組設(shè)3復(fù)孔，隨行正常對(duì)照，37 ℃、5%CO2孵育，每日倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況，待病毒對(duì)照孔的CPE達(dá)到+++～++++時(shí)，MTT法檢測(cè)，在酶標(biāo)儀上570 nm處測(cè)量OD值，計(jì)算病毒抑制率(%)。病毒抑制率(%)=[(OD均值藥物-OD均值病毒)/(OD均值正常-OD均值病毒)]×100%，結(jié)果見表3。

從表3可以看出，病毒對(duì)細(xì)胞有致病變作用，病毒對(duì)照組的OD值明顯降低，與正常對(duì)照組比較，有極顯著性差異(P<0.01)；黃芩總黃酮、梔子總環(huán)烯醚萜苷及其組合物含藥血清均可緩解細(xì)胞的病變程度，具有一定的抑制病毒細(xì)胞內(nèi)增殖的作用，其中，黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物含藥血清的1∶8和1∶16稀釋比例、黃芩總黃酮含藥血清的1∶8稀釋比例作用較強(qiáng)，這些組別的OD值明顯提高，與病毒對(duì)照組比較，有極顯著性或顯著性差異(P<0.01，P<0.05)；黃芩總黃酮含藥血清和梔子總環(huán)烯醚萜苷含藥血清的1∶16和1∶32稀釋比例的藥效作用較弱，這些組別的OD值明顯降低，與黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物(血清濃度1∶8)組比較，有顯著性差異(P<0.05)。

表3 含藥血清對(duì)病毒細(xì)胞內(nèi)增殖的影響(MTT法)

2.6 含藥血清對(duì)病毒的直接殺滅作用[11-12]96孔板中，細(xì)胞長(zhǎng)成薄單層后，傾去原有培養(yǎng)液，Hank＇s液洗2次。含藥血清和空白血清分別與20倍TCID50量病毒等體積混合，37 ℃、5%CO2孵育1 h后，分別接種于細(xì)胞上，150 μL/孔，每組設(shè)3復(fù)孔，37 ℃、5%CO2孵育，同上法培養(yǎng)與檢查。結(jié)果見表4。

從表4可以看出，病毒對(duì)細(xì)胞有致病變作用，病毒對(duì)照組的OD值明顯降低，與正常對(duì)照組比較，有極顯著性差異(P<0.01)；黃芩總黃酮、梔子總環(huán)烯醚萜苷及其組合物含藥血清均可緩解細(xì)胞的病變程度，對(duì)病毒具有一定的直接殺滅作用，其中，黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物含藥血清的1∶8和1∶16稀釋比例、黃芩總黃酮含藥血清的1∶8稀釋比例作用較強(qiáng)，這些組別的OD值明顯提高，與病毒對(duì)照組比較，有顯著性差異(P<0.05)；黃芩總黃酮含藥血清和梔子總環(huán)烯醚萜苷含藥血清的1∶16和1∶32稀釋比例的藥效作用較弱，這些組別的OD值明顯降低，與黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物(血清濃度1∶8)組比較，有顯著性差異(P<0.05)。

表4 含藥血清對(duì)病毒的直接殺滅作用(MTT法)

3 討論

上呼吸道感染，系因多種致病菌、病毒或細(xì)菌病毒共同侵害肺部所致，屬中醫(yī)溫?zé)岵》懂燵13]，是醫(yī)學(xué)臨床上的常見病、多發(fā)病，被稱為“百病之源”。王樹云報(bào)道[14]，肺部感染疾病中，最常見的致病菌為肺炎球菌，流感病毒A型和B型是引起人類發(fā)生流感相關(guān)疾病和死亡最重要的病毒類型。上呼吸道感染若治療不當(dāng)，機(jī)體持續(xù)高熱，抵抗力降低，病原體在體內(nèi)大量繁殖，并產(chǎn)生大量?jī)?nèi)毒素，內(nèi)毒素可在分子水平上(主要通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng))活化效應(yīng)細(xì)胞，啟動(dòng)并放大機(jī)體的炎癥反應(yīng)，造成機(jī)體的炎癥反應(yīng)與抗炎反應(yīng)失衡，從而形成急性肺損傷，進(jìn)而侵害各臟器及神經(jīng)系統(tǒng)[15]。正常情況下，肺上皮細(xì)胞層由I型和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞構(gòu)成。I型上皮細(xì)胞占90%，構(gòu)成上皮細(xì)胞屏障的主體部分，但抵抗損傷的能力較弱。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞是一種多功能細(xì)胞，它是I型和Ⅱ型上皮細(xì)胞的祖細(xì)胞，在正常細(xì)胞更新和損傷后修復(fù)過(guò)程中，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞可以分化為I型上皮細(xì)胞，具有合成和分泌表面活性物質(zhì)，維持肺泡內(nèi)外液體平衡的作用。急性肺損傷時(shí)幾乎肺內(nèi)所有種類的細(xì)胞都會(huì)受累，并釋放大量的細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，而肺上皮細(xì)胞既是效應(yīng)細(xì)胞又是致病因子作用的靶細(xì)胞[16]。因此，保持肺泡上皮細(xì)胞的完整性對(duì)于保持肺功能(氣體交換、屏障及分泌表面活性物質(zhì)等)極其重要。

為進(jìn)一步證實(shí)黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物抗病毒效應(yīng)與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)性，本研究采用血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，以對(duì)H1N1敏感的A549細(xì)胞為載體，觀察黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物含藥血清、黃芩總黃酮含藥血清和梔子總環(huán)烯醚萜苷含藥血清對(duì)H1N1在A549細(xì)胞內(nèi)增殖的抑制作用以及對(duì)H1N1的直接殺傷作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物含藥血清、黃芩總黃酮含藥血清和梔子總環(huán)烯醚萜苷含藥血清均可減輕H1N1對(duì)A549細(xì)胞的攻擊性，對(duì)H1N1的A549細(xì)胞內(nèi)增殖具有明顯的抑制作用，對(duì)H1N1有一定的直接殺滅作用，并具有量效關(guān)系，但黃芩總黃酮、梔子總環(huán)烯醚萜苷的效果不及二者質(zhì)量比例為3∶1的組合物，從而進(jìn)一步證實(shí)了黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物的抗H1N1效應(yīng)，這與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致[3]。據(jù)此，黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物可能通過(guò)抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖和對(duì)病毒的直接殺滅作用，來(lái)發(fā)揮其抗病毒效應(yīng)。因黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物含藥血清的作用與黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物的直接作用具有一定的相似性，后續(xù)研究中可通過(guò)比對(duì)黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物含藥血清與黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物的化學(xué)成分差異，對(duì)黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物中的抗病毒效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行研究，尋找其活性物質(zhì)群，為其作用機(jī)制的深入研究及抗病毒中藥新藥的發(fā)現(xiàn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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