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黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜對(duì)含藥小鼠血清體外抗病毒作用

2014-04-02 00:33:58代文飛
中成藥 2014年4期
關(guān)鍵詞:黃酮血清

姚 干, 王 允, 劉 毅, 陶 勇, 代文飛, 王 皓, 劉 恒

(重慶郵電大學(xué)生物信息學(xué)院,重慶 400065)

黃芩、梔子是常用的清熱解毒類中藥,現(xiàn)代對(duì)其活性成分的研究報(bào)道較多[1-3]。黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物,具有抗菌、抗病毒、解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎等作用,臨床上可用于治療上呼吸道感染[4-6]。本研究采用A549細(xì)胞制作細(xì)胞病理模型,結(jié)合血清藥理學(xué)和細(xì)胞藥理學(xué)方法及技術(shù),觀察黃芩總黃酮、梔子總環(huán)烯醚萜苷及其組合物含藥血清的體外抗H1N1作用,以期對(duì)黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物抗病毒作用機(jī)制的闡釋提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 病毒株與細(xì)胞株 甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株A/PR/8/34(H1N1),中國疾病預(yù)防控制中心。9日齡雞胚尿囊腔連續(xù)傳代2次,血凝滴度為1∶512。人肺腺癌細(xì)胞株A549,武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動(dòng)物 KM種小鼠,6~8周齡,體質(zhì)量(20±2)g,重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究室(許可證號(hào):310101001)。

1.3 藥物 黃芩總黃酮[7](純度97%,含黃芩苷80%,1 g相當(dāng)于生藥14.5 g)、梔子總環(huán)烯醚萜苷[8](純度84%,含梔子苷62%,1 g相當(dāng)于生藥20.0 g)、黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物[6](以3∶1的質(zhì)量比例組成),由本實(shí)驗(yàn)室制備,臨用前用蒸餾水分別制成質(zhì)量濃度為13.8、10.0、12.6 mg/mL的藥液,必要時(shí)少量Tween-80助溶。利巴韋林片(四川美大康藥業(yè)股份有限公司,批號(hào)110405,規(guī)格:0.1g/片),臨用前用蒸餾水制成質(zhì)量濃度為1.875 mg/mL的藥液。

1.4 試劑 DMEM培養(yǎng)基,胎牛血清(FBS),Invitrogen公司;胰蛋白酶,GIBCO公司;二甲基亞砜(DMSO),SIGMA公司;Hank's平衡緩沖溶液,Thermo Scientific公司;戊巴比妥鈉,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海)。

1.5 儀器 Napco-5100型CO2培養(yǎng)箱,美國;550型酶標(biāo)儀,Bio-Rad,美國;生物安全柜,上海榮能;倒置顯微鏡,LEICA,德國。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞復(fù)蘇后,接種于玻璃培養(yǎng)瓶中,加入10%FBS-DMEM培養(yǎng)液,37 ℃、5%CO2孵育。細(xì)胞長滿瓶底后,0.25%胰酶消化,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL。

2.2 含藥血清制備 取小鼠50只,隨機(jī)分為5組,每組10只,雌雄各半。各組按40 mL/kg灌胃給藥,連續(xù)6 d。其中,生理鹽水組給予生理鹽水,利巴韋林組給予利巴韋林75 mg/kg,黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物組給予黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物504 mg/kg,黃芩總黃酮組給予黃芩總黃酮552 mg/kg,梔子總環(huán)烯醚萜苷組給予梔子總環(huán)烯醚萜苷400 mg/kg。末次給藥后1 h,深度麻醉,心臟無菌采血,3 000 r/min離心10 min,同組血清混合,56 ℃水浴30 min,0.22 μm微孔濾膜過濾,EP管分裝,0.5 mL/支,-80 ℃冰箱保存。

2.3 含藥血清的細(xì)胞毒性界限(TC0)測(cè)定[9-10]細(xì)胞接種于96孔板中,100 μL/孔,加入10%FBS-DMEM培養(yǎng)液,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)至單層細(xì)胞,棄去原培養(yǎng)液,Hank's液洗2次。用10% FBS-DMEM培養(yǎng)液將空白血清和含藥血清做1∶2~1∶64倍比稀釋,分別加入細(xì)胞中,150 μL/孔,每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照,37 ℃、5%CO2孵育,每日觀察細(xì)胞的生長情況,連續(xù)3 d,與空白細(xì)胞相比,以細(xì)胞不出現(xiàn)退變、變形、脫落的最小稀釋度為含藥血清的無毒界限(TC0)。結(jié)果見表1。

表1 空白血清及含藥血清對(duì)A549細(xì)胞生長的影響(n=3)

從表1可以看出,空白血清和含藥血清的稀釋比例分別在1∶4和1∶8以上時(shí),對(duì)A549細(xì)胞的生長無影響,故確定含藥血清對(duì)細(xì)胞的無毒界限(TC0)為1∶8。

2.4 病毒的半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(TCID50)測(cè)定[9-10]96孔板中,細(xì)胞長成薄單層后,傾去原培養(yǎng)液,Hank's液洗2次。病毒解凍后,用DMEM培養(yǎng)液稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-66個(gè)稀釋度,分別接種于細(xì)胞上,100 μL/孔,每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,37 ℃、5%CO2孵育,1 h后棄去原培養(yǎng)液,Hank's 液洗2次,加入10% FBS-DMEM培養(yǎng)液150 μL/孔,隨行細(xì)胞對(duì)照。37 ℃、5%CO2孵育,48~72 h內(nèi)倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的病變(CPE)情況,Reed-Muench法計(jì)算TCID50。結(jié)果見表2。

表2 病毒對(duì)A549細(xì)胞的致病變作用(n=3)

從表2可以看出,接種病毒后,細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的病變,并隨病毒液稀比例(10-4~10-1)的增加而增強(qiáng)。根據(jù)表2中細(xì)胞的病變情況,采用Reed-Muench法計(jì)算,得到病毒的TCID50為10-2.9/0.1 mL。

2.5 含藥血清對(duì)病毒細(xì)胞內(nèi)增殖的影響[11-12]實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞病變效應(yīng)法(Cytopathogenic effect, CPE)。96孔板中,細(xì)胞長成薄單層后,傾去原培養(yǎng)液,Hank's液洗2次后,加入20倍量TCID50病毒攻擊,100 μL/孔,37 ℃、5%CO2孵育,1 h后棄去原病毒液,Hank's 液洗2次,加入含藥血清或空白血清,150 μL/孔,每組設(shè)3復(fù)孔,隨行正常對(duì)照,37 ℃、5%CO2孵育,每日倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況,待病毒對(duì)照孔的CPE達(dá)到+++~++++時(shí),MTT法檢測(cè),在酶標(biāo)儀上570 nm處測(cè)量OD值,計(jì)算病毒抑制率(%)。病毒抑制率(%)=[(OD均值藥物-OD均值病毒)/(OD均值正常-OD均值病毒)]×100%,結(jié)果見表3。

從表3可以看出,病毒對(duì)細(xì)胞有致病變作用,病毒對(duì)照組的OD值明顯降低,與正常對(duì)照組比較,有極顯著性差異(P<0.01);黃芩總黃酮、梔子總環(huán)烯醚萜苷及其組合物含藥血清均可緩解細(xì)胞的病變程度,具有一定的抑制病毒細(xì)胞內(nèi)增殖的作用,其中,黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物含藥血清的1∶8和1∶16稀釋比例、黃芩總黃酮含藥血清的1∶8稀釋比例作用較強(qiáng),這些組別的OD值明顯提高,與病毒對(duì)照組比較,有極顯著性或顯著性差異(P<0.01,P<0.05);黃芩總黃酮含藥血清和梔子總環(huán)烯醚萜苷含藥血清的1∶16和1∶32稀釋比例的藥效作用較弱,這些組別的OD值明顯降低,與黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物(血清濃度1∶8)組比較,有顯著性差異(P<0.05)。

表3 含藥血清對(duì)病毒細(xì)胞內(nèi)增殖的影響(MTT法)

2.6 含藥血清對(duì)病毒的直接殺滅作用[11-12]96孔板中,細(xì)胞長成薄單層后,傾去原有培養(yǎng)液,Hank's液洗2次。含藥血清和空白血清分別與20倍TCID50量病毒等體積混合,37 ℃、5%CO2孵育1 h后,分別接種于細(xì)胞上,150 μL/孔,每組設(shè)3復(fù)孔,37 ℃、5%CO2孵育,同上法培養(yǎng)與檢查。結(jié)果見表4。

從表4可以看出,病毒對(duì)細(xì)胞有致病變作用,病毒對(duì)照組的OD值明顯降低,與正常對(duì)照組比較,有極顯著性差異(P<0.01);黃芩總黃酮、梔子總環(huán)烯醚萜苷及其組合物含藥血清均可緩解細(xì)胞的病變程度,對(duì)病毒具有一定的直接殺滅作用,其中,黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物含藥血清的1∶8和1∶16稀釋比例、黃芩總黃酮含藥血清的1∶8稀釋比例作用較強(qiáng),這些組別的OD值明顯提高,與病毒對(duì)照組比較,有顯著性差異(P<0.05);黃芩總黃酮含藥血清和梔子總環(huán)烯醚萜苷含藥血清的1∶16和1∶32稀釋比例的藥效作用較弱,這些組別的OD值明顯降低,與黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物(血清濃度1∶8)組比較,有顯著性差異(P<0.05)。

表4 含藥血清對(duì)病毒的直接殺滅作用(MTT法)

3 討論

上呼吸道感染,系因多種致病菌、病毒或細(xì)菌病毒共同侵害肺部所致,屬中醫(yī)溫?zé)岵》懂燵13],是醫(yī)學(xué)臨床上的常見病、多發(fā)病,被稱為“百病之源”。王樹云報(bào)道[14],肺部感染疾病中,最常見的致病菌為肺炎球菌,流感病毒A型和B型是引起人類發(fā)生流感相關(guān)疾病和死亡最重要的病毒類型。上呼吸道感染若治療不當(dāng),機(jī)體持續(xù)高熱,抵抗力降低,病原體在體內(nèi)大量繁殖,并產(chǎn)生大量內(nèi)毒素,內(nèi)毒素可在分子水平上(主要通過信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng))活化效應(yīng)細(xì)胞,啟動(dòng)并放大機(jī)體的炎癥反應(yīng),造成機(jī)體的炎癥反應(yīng)與抗炎反應(yīng)失衡,從而形成急性肺損傷,進(jìn)而侵害各臟器及神經(jīng)系統(tǒng)[15]。正常情況下,肺上皮細(xì)胞層由I型和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞構(gòu)成。I型上皮細(xì)胞占90%,構(gòu)成上皮細(xì)胞屏障的主體部分,但抵抗損傷的能力較弱。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞是一種多功能細(xì)胞,它是I型和Ⅱ型上皮細(xì)胞的祖細(xì)胞,在正常細(xì)胞更新和損傷后修復(fù)過程中,肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞可以分化為I型上皮細(xì)胞,具有合成和分泌表面活性物質(zhì),維持肺泡內(nèi)外液體平衡的作用。急性肺損傷時(shí)幾乎肺內(nèi)所有種類的細(xì)胞都會(huì)受累,并釋放大量的細(xì)胞因子和炎性介質(zhì),而肺上皮細(xì)胞既是效應(yīng)細(xì)胞又是致病因子作用的靶細(xì)胞[16]。因此,保持肺泡上皮細(xì)胞的完整性對(duì)于保持肺功能(氣體交換、屏障及分泌表面活性物質(zhì)等)極其重要。

為進(jìn)一步證實(shí)黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物抗病毒效應(yīng)與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)性,本研究采用血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,以對(duì)H1N1敏感的A549細(xì)胞為載體,觀察黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物含藥血清、黃芩總黃酮含藥血清和梔子總環(huán)烯醚萜苷含藥血清對(duì)H1N1在A549細(xì)胞內(nèi)增殖的抑制作用以及對(duì)H1N1的直接殺傷作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物含藥血清、黃芩總黃酮含藥血清和梔子總環(huán)烯醚萜苷含藥血清均可減輕H1N1對(duì)A549細(xì)胞的攻擊性,對(duì)H1N1的A549細(xì)胞內(nèi)增殖具有明顯的抑制作用,對(duì)H1N1有一定的直接殺滅作用,并具有量效關(guān)系,但黃芩總黃酮、梔子總環(huán)烯醚萜苷的效果不及二者質(zhì)量比例為3∶1的組合物,從而進(jìn)一步證實(shí)了黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物的抗H1N1效應(yīng),這與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致[3]。據(jù)此,黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物可能通過抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖和對(duì)病毒的直接殺滅作用,來發(fā)揮其抗病毒效應(yīng)。因黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物含藥血清的作用與黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物的直接作用具有一定的相似性,后續(xù)研究中可通過比對(duì)黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物含藥血清與黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物的化學(xué)成分差異,對(duì)黃芩總黃酮和梔子總環(huán)烯醚萜苷組合物中的抗病毒效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行研究,尋找其活性物質(zhì)群,為其作用機(jī)制的深入研究及抗病毒中藥新藥的發(fā)現(xiàn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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