虛擬篩選白芷治療硝酸甘油誘導的偏頭痛的活性成分

茍美玲， 李 玲， 楊文宇， 何宇新

(西華大學生物工程學院，四川 成都 610039)

白芷為傘形科多年生草本植物白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm)Benth.et Hook.f或杭白芷A.dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss)Shan.et Yuan的干燥根。白芷成分復雜，作用靶點較多，作用方式復雜，已知化學成分對各靶點的作用尚難以用藥效學實驗一一驗證。為全面揭示白芷治療偏頭痛作用機制，一種理想化的方法是：將代謝預測技術與虛擬篩選方法相結合，針對白芷治療偏頭痛所涉及到的作用靶點，用計算機軟件逐一模擬體內的相互作用，進行對接、評分，從而初步篩選治療偏頭痛的活性成分，將篩選出的活性化合物再進行有針對性的藥理活性實驗驗證，可避免常規篩選方法的盲目性，能夠大大縮短活性成分篩選時間，為進一步揭示白芷治療偏頭痛作用機理奠定基礎，并能節省大量的研究經費，為天然藥物活性成分篩選建立快捷通道。

本實驗在白芷化學成分研究的基礎上，以歐前胡素、異歐前胡素、花椒毒素、白當歸素等20種化合物[1-6]為配體，借助Molegro Vitual Docker軟件的Docking模塊分別與5-HT、N-甲基-D-天門冬氨酸、多巴胺D3受體、降鈣素基因相關肽[7-9]、前列腺素、血管緊張素轉換酶以及一氧化氮合酶8種治療偏頭痛所涉及的作用靶點(見表1)進行分子對接，根據這些已知化合物與靶點的對接親和能大小和對接位點數進行計算機評分，分析白芷治療偏頭痛的活性成分[10-11]，為進一步的動物性實驗設計提供有效依據。

表1 20種化學成分的待對接靶點

由于硝酸甘油型偏頭痛動物模型的病理變化及癥狀表現與人類偏頭痛發作時的變化及表現相似性較好，且實驗制作方法簡便，實驗條件較易控制，在復制大量的動物模型研究使用中能大大縮短時間，是目前國內研究中運用最多的偏頭痛模型，故在本次研究中采用這種模型進行研究。

1 材料與方法

1.1 軟件、硬件的準備

1.1.1 軟件

1.1.1.1 Chemsketch 10.0軟件 繪制白芷中化學分子結構軟件。

1.1.1.2 Corina在線轉換程序(http://www.molecular-networks.com) 對白芷中化學分子結構進行三維優化。

1.1.1.3 Molegro Virtual Docker 2007 Trial(Molegro ApS，MVD 2007，Denmark， Aarhus，http://www.molegro. com) 具有高精度對接程序虛擬對接軟件。

1.1.2 設備 戴爾Dimension E530臺式計算機(intel core2 E4500處理器，1.80 GHz，2.00 Gb內存， Microsoft Windows 7 Professional操作系統)。

1.1.3 藥物 白當歸素、東莨菪苷、硬脂酸、水合氧化前胡素、歐前胡素、白芷內酯，蒸餾水(含0.5%吐溫-80)配成所需質量濃度的混懸液備用。

1.1.4 試劑 硝酸甘油注射液，河南潤弘制藥股份有限公司；麥角胺咖啡因片，哈爾濱泰華藥業股份有限公司。

1.1.5 動物 SD大鼠，雌雄兼用，體質量200 g左右，由成都中醫藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號scxl(川2013-05)。

1.2 活性靶點結構和參考配體信息來源及處理 從蛋白質數據庫(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)下載治療偏頭痛作用涉及的以下靶點三維結構模型：5-HT、N-甲基-D-天門冬氨酸受體、多巴胺D3受體、降鈣素基因相關肽、前列腺素、血管緊張轉換酶以及一氧化氮合酶。將以上8個靶點的單晶衍射圖中的乙酸分子、水分子、金屬離子用Molegro Virtual Docker軟件除去，只保留這8個蛋白分子與原始配體，最后得到可用于對接的5-HT、N-甲基-D-天門冬氨酸受體、多巴胺D3受體、降鈣素基因相關肽、前列腺素、血管緊張素轉換酶以及一氧化氮合酶的三維立體結構。

1.3 配體化合物的三維結構優化 將白芷中已知的20種化合物作為對接所需的配體小分子化合物庫，首先利用ChemSketch 10.0軟件的繪圖功能，繪制出化合物的平面結構圖(見表2)，然后從CORINA—Fast Generation of High-Quality 3D Molecular Models (http://www.molecular-networks.com/products/corina)中產生三維結構并進行優化。

1.4 配體與活性靶點的分子對接 首先啟動Molegro Virtual Docker 2007軟件，移入治療偏頭痛靶點三維結構，同時檢測作用靶點活性結構，然后移入已進行三維結構優化的20種化合物分子。設置Molegro Virtual Docker 2007軟件中各種對接運行參數，接著運行對接模塊、進行虛擬對接運算，保存運算結果。最后分析運算結果和各種參數的相互關系，預測對接結果中各配體分子結合方式的分子對接評分，根據分子對接評分絕對值進行排序，與參考配體評分進行對比，從而篩選出有潛在活性的成分[12]。

表2 20種化學成分的二維結構

1.5 虛擬篩選確定的活性成分對硝酸甘油型偏頭痛動物模型的影響[13]取SD大鼠90只，雌雄各半，按體質量隨機分層分為9組，每組10只，分別為空白組、模型組、陽性組、白當歸素組、東莨菪苷組、硬脂酸組、水合氧化前胡素組、歐前胡素組、白芷內酯組。除空白組外其余8組動物進行硝酸甘油型偏頭痛模型造模(于大鼠皮下注射硝酸甘油10 mg/kg，以出現前肢頻繁搔頭、雙耳發紅等預示造模成功)，同時記錄下各組大鼠耳紅出現時間。造模15 min后，陽性組予麥角胺咖啡因溶液灌胃，實驗組則予上述虛擬篩選所得活性成分混懸液，空白組和模型組予等容積實驗時用蒸餾水(含0.5%吐溫-80助溶)灌胃。給藥后4 h內，觀察并對各組大鼠耳紅消失時間進行記錄，同時以每0.5 h為一個時間段，觀察各組大鼠在每0.5 h爬籠次數和內撓頭次數，以大鼠前肢抓籠蓋為爬籠行為癥狀的記錄標志，以大鼠后肢撓頭為撓頭行為記錄標志。

1.6 統計學方法 采用PEMS 3.1統計軟件包進行。兩兩比較選用t檢驗，多組比較選用方差分析，差齊性選用 LSD 或 Tukey 等多重比較，方差不齊選用Tamhane＇s T2多重比較。

2 結果與分析

2.1 白芷治療偏頭痛活性成分的虛擬篩選結果與分析

2.1.1 針對一氧化氮合酶虛擬篩選的結果 參考配體L-NAME的評分為-79.174，白芷的化學成分中與一氧化氮合酶對接時分子對接評分絕對值大于L-NAME評分90%的分子且MolDockScore評分排序前10的分子見表3。

表3 與一氧化氮合酶靶點分子對接評分排序前10的化合物

2.1.2 針對血管緊張素轉換酶的虛擬篩選結果 參考配體血管緊張素轉換酶抑制劑的評分為-131.852，白芷的化學成分中與血管緊張素轉換酶對接時分子對接評分絕對值排序前6的分子見表4。

表4 與血管緊張素轉換酶靶點分子對接評分排序前6的化合物

2.1.3 針對腎上腺素-β虛擬篩選的結果 參考配體普萘洛爾的評分為-104.136，白芷的化學成分中與腎上腺素-β對接時分子對接評分絕對值大于普萘洛爾評分90%的分子且MolDockScore評分排序前10的分子見表5。

表5 與腎上腺素-β靶點分子對接評分排序前10的化合物

2.1.4 針對前列腺素的虛擬篩選結果 參考配體吲哚美辛的評分為-110.224，白芷的化學成分中與前列腺素對接時分子對接評分絕對值排序前6的分子見表6。

表6 與前列腺素靶點分子對接評分排序前6的化合物

2.1.5 針對降鈣素基因相關肽虛擬篩選的結果 參考配體吳茱萸次堿的評分為-108.399，白芷的化學成分中與降鈣素基因相關肽對接時分子對接評分絕對值大于吳茱萸次堿評分90%的分子且MolDockScore評分排序前10的分子見表7。

2.1.6 針對多巴胺D3受體虛擬篩選的結果 參考配體BP-897的評分為-130.229，白芷的化學成分中與多巴胺D3受體對接時分子對接評分絕對值大于MK-801評分90%的分子且MolDockScore評分排序前10的分子見表8。

表7 與降鈣素基因相關肽靶點分子對接評分排序前10的化合物

表8 與多巴胺D3受體靶點分子對接評分排序前10的化合物

2.1.7 針對N-甲基-D天門冬氨酸受體虛擬篩選的結果 參考配體MK-801的評分為-92.204，白芷的化學成分中與N-甲基-D天門冬氨酸受體對接時分子對接評分絕對值大于MK-801評分90%的分子且MolDockScore評分排序前10的分子見表9。

2.1.8 針對5-HT受體虛擬篩選的結果 參考配體阿米替林的評分為-92.204，白芷的化學成分中與5-HT受體對接時分子對接評分絕對值大于阿米替林評分90%的分子且MolDockScore評分排序前10的分子見表10。

表9 與N-甲基-D天門冬氨酸受體靶點分子對接評分排序前10的化合物

表10 與5-HT受體靶點分子對接評分排序前10的化合物

2.1.9 分析 以上虛擬篩選結果說明：(1)針對上述8個作用靶點篩出的理論活性成分可能在一定程度上反映了白芷治療偏頭痛的物質基礎，值得進一步進行藥理實驗驗證；(2)白芷治療偏頭痛可能主要針對多巴胺受體D3、降鈣素基因相關肽、前列腺素、血管緊張素轉換酶4個靶點，這需要進一步擴大靶點篩選范圍進行確證；(3)部分化學成分可能具有多靶點活性，見表11。

表11 具有多靶點活性的化學成分

表11結果顯示：通過白芷中20種化學成分針對8個治療偏頭痛相關靶點的虛擬篩選，并與參考配體評分絕對值進行對比，發現白芷中的白當歸素、東莨菪苷、硬脂酸、水合氧化前胡素、歐前胡素、白芷內酯6種成分對多個治療偏頭痛相關靶點有抑制活性。正是這種可能存在的單分子的多靶點作用，為中藥針對單靶點藥效不強提供了可能的解決方法，使得白芷治療偏頭痛作用表現出整體治療、調制并舉的特點。現目前中醫藥研究領域的難點之一就有用當代醫學語言解釋白芷這種整體治療的特色與原理，因此這一結果為進一步研究白芷整體治療偏頭痛提供了有利依據。

2.2 藥效學實驗結果與分析

2.2.1 虛擬篩選確定的活性成分對硝酸甘油致偏頭痛大鼠耳紅癥狀的影響結果，見表12。

表12結果顯示：虛擬篩選所得活性成分白當歸素、東莨菪苷、水合氧化前胡素、歐前胡素可明顯縮短耳紅消失時間，與模型組比較有顯著差異(P<0.05)，硬脂酸、白芷內酯也存在相同的作用趨勢，但無統計學意義。

2.2.2 虛擬篩選確定的活性成分對硝酸甘油致偏頭痛大鼠撓頭次數的影響結果，見表13。

表12 虛擬篩選確定的活性成分對硝酸甘油致偏頭痛大鼠耳紅癥狀的影響

表13 虛擬篩選確定的活性成分對硝酸甘油致偏頭痛大鼠撓頭次數的影響

表13結果顯示：虛擬篩選所得活性成分白當歸素、東莨菪苷、水合氧化前胡素、歐前胡素可明顯減少偏頭痛模型大鼠撓頭次數，與模型組比較有顯著差異(P<0.05)，硬脂酸、白芷內酯也存在相同的作用趨勢，但無統計學意義。

2.2.3 虛擬篩選確定的活性成分對硝酸甘油致偏頭痛大鼠爬籠次數的影響結果，見表14。

表14 虛擬篩選確定的活性成分對硝酸甘油致偏頭痛大鼠爬籠次數的影響

表14結果顯示：虛擬篩選所得活性成分白當歸素、東莨菪苷、硬脂酸、水合氧化前胡素、歐前胡素、白芷內酯對大鼠爬籠次數無明顯影響。

2.2.4 分析 上述硝酸甘油型偏頭痛動物模型的研究結果顯示：虛擬篩選所得活性成分白當歸素、東莨菪苷、水合氧化前胡素、歐前胡素對硝酸甘油型偏頭痛模型有明顯影響，硬脂酸、白芷內酯對硝酸甘油型偏頭痛模型的影響不明顯。

3 結論

3.1 本實驗所用的MVD分子對接軟件的基本原理是利用各種參數主要包括電性參數、立體參數、疏水參數等對配體分子與靶點分子的相互作用進行模擬，從而給出白芷化學成分與所選取的8個治療偏頭痛相關靶點相互作用的評分，根據與參考配體評分絕對值比較預測配體的活性。這些所用的的參數都是建立在大量實驗數據基礎之上的，并且決定著對接軟件精度。

3.2 虛擬篩選能為隨后的藥效學驗證實驗提供有用的線索和基礎，將虛擬篩選與藥效學實驗研究結合將能更快速和全面地明確白芷治療偏頭痛有效成分和多種藥效指標間的復雜對應關系，從而為進一步揭示白芷治療偏頭痛作用機制奠定基礎。

3.3 基于虛擬篩選的白芷藥效物質基礎研究是在中醫理論指導下的研究，現目前整體治療偏頭痛作用還不能被白芷中的任何一種化學成分全面反映和體現，這也是與大多數學者發現中藥活性成分越純，但藥理作用越差的重要原因所在，因此在虛擬篩選中除了考慮配體與受體的相互作用外，還要考慮分子的化學穩定性、類藥性、毒性和合成的難易性以及體內轉運和代謝分布等藥代動力學方面的性質。

3.4 硝酸甘油型偏頭痛動物模型的研究結果顯示：白芷中白當歸素、東莨菪苷、水合氧化前胡素、歐前胡素對硝酸甘油型偏頭痛的影響較明顯，通過藥效學實驗對虛擬篩選出的白芷治療偏頭痛活性成分的有效性進行了初步驗證。

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